六味地黄丸含药血清调控黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用

                作者：杜标炎，张小贺，谭宇蕙，吴映雅，易华，郭玉荣 

【摘要】  　　【目的】观察六味地黄丸含药血清调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白（Cx）表达的作用。【方法】采用SD大鼠灌胃8d制备六味地黄丸含药血清（药物剂量为32g·kg-1·d-1）和对照血清（灌胃等容积生理盐水）；选择对B16细胞生长和形态影响不大的血清浓度（体积分数为10%）作为大鼠血清的工作浓度；采用Western blot技术和间接免疫荧光法及流式荧光法检测六味地黄丸含药血清对黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白（Cx26/30/32）表达的影响。【结果】Western blot检测显示空白组（无鼠血清）3种Cx几乎不表达，而对照血清和六味地黄丸各浓度含药血清均能提高Cx蛋白的表达，但含药血清的作用更为明显且有显著的量效关系；间接免疫荧光法和流式荧光法检测显示类似的结果：对照血清组和中、高剂量含药血清组的Cx蛋白荧光强度均较空白组显著增加（P＜0?01），但与对照血清组比较，只有高剂量含药血清组荧光强度显著增加（P＜0?05），低剂量含药血清组Cx蛋白表达反而下降(P＜0?01)。【结论】六味地黄丸含药血清具有调控小鼠黑色素瘤B16细胞株缝隙连接蛋白表达的作用。

【关键词】  肿瘤/中西医结合疗法；六味地黄丸/药；黑色素瘤；基因；肿瘤细胞，培养的

　　Abstract: Objective To investigate the regulatory effect of medicated serum of Liuwei Dihuang Bolus (LDB) on the expression of connexins (Cxs) in mice melanoma B16 cells.MethodsMedicated serum was obtained from SD rats which were treated with LDB at the dose of 32g·kg-1·d-1 and non?medicated serum was obtained from rats receiving normal saline by gavage for 8 days. The rat serum at the concentration of 10% (V/V) served as the working solution. The expression of connexins (Cx26/30/32) was detected by using western blot method，indirect immunofluorescence assay and fluorescence activated cell sorter (FACS) assay.ResultsThe results of western blot assay showed that Cx26/30/32 was undetectable in the blank group(without use of rat serum)，while the amount of Cx26/30/32 in B16 cells were up?regulated by rat control serum and the medicated serum，the up?regulation of medicated serum being obvious and in a dose?effect manner.Indirect immunofluorescence assay and FACS assay showed similar results: the fluorescence intensity in the groups treated with rat control serum and medicated serums was higher than that in the blank group(P＜0?01)；the fluorescence intensity in the group of high?dose medicated serum was higher than that in the control serum group(P＜0?05)，and Cx expression was decreased in the group of low?dose medicated serum (P＜0?01).Conclusion Medicated serum of LDB exerts regulatory effect on the expression of connexins in melanoma B16 cells.

　　Key words:TUMOR/TCM?WM therapy;LIUWEI DIHUANG BOLUS /pharmacology;MELANOMA;GENE THERAPY;TUMOR CELLS，CULTURED

　　缝隙连接(gap junction，GJ)是存在于细胞之间进行物质及信息交换的通道，对细胞增殖、分化及机体的生长发育至关重要［1］。近年来研究发现，缝隙连接功能复杂多样，参与许多生理及病理过程；缝隙连接蛋白（connexin,Cx）即为组成GJ通道的结构蛋白，是进行细胞间通讯的物质基础。Cx与肿瘤的发生密切相关［2］，被誉为“第二类抑癌基因” ［3］。在许多恶性肿瘤细胞中Cx基因异常低表达；有些肿瘤细胞虽能表达Cx，但由于存在Cx不能正常折叠与定位，或Cx相互聚合时排列紊乱等情况，导致不能形成结构完整有序的功能性膜通道［4］ 。上述现象使缝隙连接细胞间通讯 (gap junction intercellular communication，GJIC) 功能发生异常改变或减弱。GJIC与肿瘤自杀基因疗法的旁杀伤效应密切相关，GJIC使自杀基因系统的毒性产物能通过GJ通道传导到未转染自杀基因的细胞中而引起旁杀伤效应，是其增效作用的主要机制之一［5］。我们已有的研究结果表明，自杀基因治疗联合补肾方药六味地黄丸在体内和体外均能起到协同增效的作用［6-7］。其增效作用是否与提高肿瘤细胞的Cx表达相关？我们通过本实验进行了初步的研究，现报道如下。

　　1材料与方法

　　1?1主要试剂与仪器

　　RPMI?1640培养基为Gibico公司产品；新生牛血清为TBD公司产品；3?（4?5?二甲基?2?噻唑）?2?5?二苯基溴化四唑（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、丙烯酰胺、β?巯基乙醇、苯甲基磺酰氟（PMSF）、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等试剂均为Sigma公司产品；Cx26/30/32一抗为兔抗鼠多抗，为美国Santa cruz公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔荧光二抗、HRP?ECL发光液为美国KPL公司产品；2? 2?联喹啉?4? 4?二甲酸二钠（BCA）蛋白质定量检测试剂盒为申能博采生物科技有限公司产品；细胞培养瓶、培养板、冻存管、滤膜等均为美国Corning公司或丹麦Nunc公司产品；硝酸纤维素膜为Pall公司产品。BNA?311型CO2培养箱(日本Espec)；Extra型流式细胞仪（美国Coulter Co?Ltd）；IX71?F22FL/PH型荧光倒置显微镜（日本Olympus）；Syngene GeneGenius 型凝胶成像系统（Syngene）；20型聚丙烯酰胺凝胶蛋白垂直电泳系统（SDS?PAGE）和转膜系统（Bio?Rad）。

　　1?2细胞株小鼠恶性黑色素瘤B16细胞株购于中山大学动物中心细胞库。

　　1?3实验动物SD大鼠，体质量 230～280g，雄性，健康，清洁级,合格证号SCXK（粤）2003?0001，粤监证字2006A014；环境合格证号NO 0010470，由广州中医药大学实验动物中心提供。

　　1?4六味地黄丸含药血清和对照血清的制备及血清对细胞生长的影响［8］选用16只SD大鼠随机分为2组，对照血清组灌胃生理盐水，六味地黄丸含药血清组灌胃六味地黄丸（剂量为32g·kg-1·d-1），连续灌胃8ｄ，分别制备对照血清和含药血清，-70℃冰箱保存备用。MTT法检测各浓度对照血清和含药血清对细胞生长的影响，根据检测结果确定，各组均选择对细胞生长和细胞形态影响较小的10%（体积分数，以下同）的血清浓度为工作浓度。六味地黄丸含药血清再分为低剂量（2?5％的含药血清＋7?5％的对照血清）、中剂量（5％的含药血清＋5％的对照血清）、高剂量（10％含药血清）。

　　1?5Western blot技术检测

　　B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平实验分为无鼠血清的空白组，对照血清组，中、高剂量含药血清组共4组。将细胞培养于25cm3的培养瓶中，长至90％融合时，加入200μL细胞裂解液，细胞刮匙刮下细胞，在冰上裂解30min。裂解液于4°C下12000r／min离心10min；取上清得总蛋白提取液，测定各组蛋白浓度。取样加入1／4体积的5倍十二烷基磺酸钠（SDS)蛋白加样缓冲液，煮沸10min，进行SDS?PAGE分离蛋白，电泳后蛋白转移至硝酸纤维素膜上，丽春红染色验证蛋白转移成功。以50g/L 的脱脂奶粉封闭2h后，依次加入Cx26/30/32一抗，室温孵育2h，Tris?HCl缓冲盐溶液（TBS）／T（在TBS溶液中加入体积分数0?05%吐温20）洗2次，0?01mol/LTris 缓冲液（含8g/LNaCl、3g/LTris，pH8?0）洗1次，HRP标记二抗室温孵育 2h，TBS／T洗2次，TBS洗1次，加入HRP?ECL发光液，最后用X胶片进行曝光显影。

　　1?6间接免疫荧光法检测

　　B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平实验分为空白组，胎牛血清组，对照血清组，低、中、高剂量含药血清组共6组；在24孔板中培养B16细胞至对数期，药物作用72h后，进行固定、间接免疫荧光法染色。步骤如下：吸弃培养液，滴加0?01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，每次加1mL轻微震荡5min，以下同）冲洗标本3次，体积分数4%甲醛室温固定30min；PBS冲洗10次，50g/L小牛血清白蛋白（BSA）室温下封闭30min，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加用PBS 按1：100稀释的Cx26/30/32一抗，覆盖标本，将样品置于湿盒内，4℃过夜；用PBS冲洗10次，用滤纸吸去多余水分，滴加1：50稀释的荧光二抗(在暗室中进行)；湿盒内室温静置2h；用滤纸吸去多余水分，在荧光显微镜高倍视野蓝色激发光下观察。设阴性对照：一组不加一抗和二抗，用于荧光强度的基线校正；一组仅加二抗，用于非特异性结合对照。镜下观察到绿色荧光，说明该处有连接蛋白Cx26/30/32的存在，判定为阳性表达细胞，如无绿色荧光呈现，判定为阴性表达细胞。每个样本随机抽取8个高倍视野(×200)，在盲法摄取图像后，采用盲法评分，根据荧光表达的亮度分为（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）5个等级，具体标准由观察者掌握；计分标准为（-）记0分、（+）记1分、（++）记2分，以此类推。

　　1?7流式荧光法检测

　　B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平实验分为空白组，胎牛血清组，对照血清组，低、中、高剂量含药血清组共6组；6孔板中培养细胞至对数生长期，药物作用72h后，流式荧光法检测B16细胞Cx26/30/32表达水平。操作步骤如下：倒弃培养基，PBS洗1次，胰酶消化，离心（12000r／min，以下同）；2?5g/L的多聚甲醛固定5min，离心，吸弃甲醛，PBS洗3次；加1：50稀释的一抗，室温孵育1h；离心，弃上清，PBS洗3次；加1：10稀释的荧光二抗，暗室中室温孵育30min，离心，弃上清，PBS洗2次，PBS重悬，流式细胞仪检测，每组10000个细胞。

　　1?8统计学方法

　　采用SPSS11?5统计软件分析，多组间比较用One?Way ANOVA?LSD法。

　　2结果

　　2?1Western blot技术分析

　　B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平从图1可见，各组β?actin的含量相当，提示各上样孔中总蛋白量基本相同；而对照血清组和六味地黄丸含药血清组均大于无鼠血清的空白组，说明对照血清和含药血清均可提高Cx26/30/32的表达；但含药血清中、高剂量组Cx的表达明显强于对照血清组，且作用具有量效关系。

　　2?2间接免疫荧光法检测

　　B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平镜下观察，各组均有Cx26/30/32表达的阳性细胞，荧光主要集中在胞膜上；空白组和胎牛血清组荧光强度明显弱于对照血清组和六味地黄丸各含药血清组（图2，彩图见第200页），计分结果与肉眼镜下观察结果较一致（见表1），秩和检验分析显示含药血清中、高剂量组与空白组比较差异均具有显著性意义（P＜0?01），低、中、高剂量含药血清组提高Cx表达的作用存在量效关系。但与对照血清组比较，高剂量含药血清组荧光强度有所增加，但差异无显著性意义（P＞0?05），含药血清低剂量组Cx蛋白表达反而下降，差异有显著性意义（P＜0?01）。低、中、高剂量含药血清组组间两两比较差异均有显著性意义（P＜0?01），说明低、中、高剂量含药血清提高Cx表达的作用存在量效关系。表1各组细胞荧光强度比较（略）

　　2?3流式荧光法检测

　　B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达水平在本试验中，设立了只加二抗组，用于非特异性结合对照。而各组减去非特异性结合对照的结果即是各组10000个细胞的平均荧光光密度值。结果显示各组均有Cx表达的阳性细胞，空白组荧光强度弱于对照血清组和各含药血清组。六味地黄丸低、中、高含药血清组间提高Cx表达的作用存在量效关系，结果与间接免疫荧光法检测结果基本一致（见表2、图3）。表2流式细胞仪检测B16细胞经六味地黄丸含药血清处理后Cx表达情况（略）

　　3讨论

　　1967年Revel等［8］首次在大鼠心肌细胞间和肝细胞间发现了一种构造精妙的连接方式，并将之命名为“缝隙连接”(GJ)，从此开创了GJ研究的新纪元。生物体内相邻细胞间主要通过GJ通道互相传递信号分子，从而控制细胞间的协调生长。这种由GJ介导的细胞间物质、能量及信息的交换活动称为缝隙连接细胞间通讯(GJIC)。Cx是GJ的结构蛋白，是GJIC的物质基础，Cx的正常或异常表达，可直接影响到细胞、组织及器官的功能状态。Cx是一种整合膜蛋白，6个哑铃形Cx亚单位寡聚化形成单侧膜通道，称连接子（connexon)，相邻细胞的连接子衔接形成细胞间膜通道，即GJ通道，属于跨膜亲水性通道结构［9］。连接子的亚单位可以相同或不同，如此，各种Cx分子在数量和空间上的不同组配可形成多种连接子，不同连接子又相互组配从而形成种类庞多的缝隙连接。Cx属于多基因家族，各家族成员的基因序列具有高度同源性。依据该家族基因编码的蛋白质分子量对各成员进行命名，如Cx26、Cx32等，目前已确认哺乳动物中至少有16种Cx基因［4］。本实验采用Western blot技术检测B16细胞Cx26/30/32蛋白总表达量，结果显示与空白组比较，对照血清和六味地黄丸含药血清均可提高B16细胞的Cx表达，六味地黄丸含药血清组Cx的表达强度明显高于对照血清组，且含药血清的作用具有量效关系。只有细胞膜上Cx才是形成GJ的物质基础，GJIC功能主要取决于整合在细胞膜表面的Cx数量与质量，因而Cx蛋白总表达量的增加并不一定说明Cx介导GJIC功能的增强。本实验中我们用间接免疫荧光法和流式荧光法检测了细胞膜表面的Cx数量（由于在试验中未加入细胞膜穿孔剂，大分子的抗体不能通过细胞膜进入细胞内，因而检测到的Cx主要是细胞膜上表达的含量）。结果显示对照血清组和各含药血清组均有提高B16细胞膜Cx表达的作用；六味地黄丸低、中、高剂量含药血清提高Cx表达的作用存在量效关系。从多批次的实验结果我们均观察到两个有趣的现象。一是10%的对照血清可明显提高Cx蛋白总表达量和细胞膜Cx表达量。由于实验过程中对照血清和各含药血清均是在空白组（完全培养基）的基础上添加了10%的经过灌胃处理的大鼠血清，为了排除培养液中增加的血清量对Cx表达的影响，我们观察了在完全培养基中再加入10%胎牛血清对Cx表达的作用，结果显示10%胎牛血清对Cx表达无增强作用；那么是否血清作用具有种属特异性呢？我们又进一步地观察了10%不灌胃的大鼠血清的作用，也未显示其对Cx表达的增强作用（上述结果未显示），其结果提示灌胃剌激可促使体内产生某些活性物质，具有促进黑色素瘤B16细胞Cx表达的作用。灌胃剌激促进Cx表达作用的机制有待深入研究，我们推测可能与灌胃剌激引起的应激反应相关。通过查阅，有报道冷剌激可上调肾上腺嗜酪细胞Cx表达［10］，但对肿瘤细胞Cx表达的影响未见报道，值得进一步研究。另一有趣的现象是，当含药血清与对照血清按不同比例混合后，六味地黄丸含药血清在低剂量时具有抑制对照血清上调Cx表达的作用，而在高剂量时则又能进一步上调Cx的表达，表明六味地黄丸含药血清对Cx的表达具有双向调节作用，其作用的物质基础和具体机制及意义有待进一步阐明。本研究结果表明，六味地黄丸能调控黑色素瘤B16细胞株的Cx表达，提示六味地黄丸对黑色素瘤自杀基因具有潜在的增效的可行性。研究还表明，GJ功能在放射治疗和化学治疗的增效中也有一定的作用［11-12］，六味地黄丸能调控肿瘤细胞Cx表达，提示该方也有可能具有放、化疗增敏的可能性［13］。六味地黄丸具有广泛的药理作用，在抗衰老、抗肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、中枢神经系统功能紊乱等的治疗中被广泛应用［14-17］；Cx表达异常与衰老、肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病的发生密切相关［18-21］；六味地黄丸疾病治疗谱与Cx表达异常所致的疾病关联性非常强。其对Cx表达的调控作用是否就是其广泛药理作用的分子生物学基础，值得进一步探讨。

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