人参、三七在复方芪术调经散中的高效液相色谱法鉴别?

                   作者：何耀慧　林荣锋　陈剑平　李一圣　黄晓其　赖小平　苏子仁?

【摘要】  【目的】　建立芪术调经散中人参和三七的鉴别方法。【方法】以三七皂苷R?1和人参皂苷Rf为指标，采用高效液相色谱法对芪术调经散中人参和三七进行鉴别。【结果】通过利用人参特征性成分人参皂苷Rf和三七特征性成分三七皂苷R?1，并综合人参和三七中共有成分人参皂苷Rg?1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb?1，可对芪术调经散中人参和三七进行鉴别。【结论】该方法简便可行，可用于芪术调经散中人参和三七的同时鉴别。?

【关键词】  人参/化学;　三七/化学;　人参皂苷Rf/分析;　三七皂苷R?1/分析;　色谱法，高压液相?

人参和三七均为贵重中药材，人参有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津，安神的功效，而三七有散瘀止血，消肿定痛的功效??[1]?。同时含有人参和三七的经典方屡见不鲜，但现有尚无有关复方中同时鉴别人参和三七的报道。对于复方制剂，同时鉴别人参和三七是保证其质量的必要条件，而人参和三七含有的成分极为相似，有效成分均为皂苷类成分，均含有人参皂苷Rg?1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb?1，为鉴别增加了难度。本文以同时含有人参和三七两味药材，且制备工艺简单的芪术调经散作为研究对象，采用高效液相色谱(HPLC)法建立了芪术调经散中人参和三七的鉴别方法，现将研究结果报道如下。?

　　1　 材料?

　　1?1　仪器　?

　　DIONEX SUMMIT高效液相色谱仪(美国戴安公司);Hanest D2G?303A水艾科浦U系列纯化水机(重庆颐洋有限公司);舒美KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BP110s型万分之一天平(德国Sartorius公司) ;CP225D型十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)。?

　　1?2　药物与试剂　?

　　人参皂苷Rf(药品生物制品检定所，批号：111719?200502 );人参皂苷Re(中国药品生物制品检定所，批号0754?200013);人参皂苷Rg?1(中国药品生物制品检定所，批号：110703?200424);人参皂苷Rb?1(中国药品生物制品检定所，批号：110704?200420);三七皂苷R?1(中国药品生物制品检定所，批号：110745?200313);甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。?

　　2　方法和结果?

　　2?1　色谱条件　?

　　色谱柱：Waters YMC ODS (4?6?mm×50?mm);流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B;流速为1?0?mL/min，按表1进行梯度洗脱;柱温为27?℃;检测波长为203?nm。?表1　梯度洗脱曲线?

　　2?2　对照品溶液的制备　?

　　取三七皂苷R?1对照品、人参皂苷Rg?1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb?1对照品及人参皂苷Rf对照品适量，精密称定，加入甲醇分别制成三七皂苷R?1 0?201?mg/mL、人参皂苷Rg?1 0?940?mg/mL、人参皂苷Re 0?298?mg/mL、人参皂苷Rb?1 0?880?mg/mL及人参皂苷Rf 0?335?mg/mL的溶液，即得。?

　　2?3　对照药材溶液的制备　?

　　取人参药材1?g，精密称定，加三氯甲烷40?mL，超声处理1?h，滤过，药渣加适量水湿润后，加水饱和正丁醇10?mL，超声处理30?min，滤过，取上清液加30?mL氨试液，摇匀，放置分层，取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至1?mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得人参对照药材溶液;同法制得三七对照药材溶液。?

　　2?4　供试品溶液的制备　?

　　取芪术调经散14?29?g，精密称定，加三氯甲烷100?mL，超声处理1?h，滤过，药渣加适量水湿润后，加水饱和正丁醇100?mL，超声处理30?min，滤过，取上清液加300?mL氨试液，摇匀，放置分层，取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至1?mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。?

　　2?5　阴性样品溶液的制备　?

　　按本品处方及制备工艺，同供试品溶液的制备方法制得缺人参阴性样品溶液、缺三七阴性样品溶液及缺人参、三七双阴性样品溶液。?

　　2?6　样品测定　?

　　分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10?μL，注入高效液相色谱仪，测定即得。结果见表2、图1。?表2　芪术调经散中皂苷类成分的保留时间由表2和图1可知，人参和三七中含有共同成分人参皂苷Rg?1、人参皂苷Re及人参皂苷Rb?1，三七皂苷R?1为三七的特征性成分，人参皂苷Rf为人参中的特征性成分。结果表明，在此高效液相色谱条件下，通过三七的特征性成分三七皂苷R?1和人参的特征性成分人参皂苷Rf可有效鉴别芪术调经散中的人参和三七成分。?

　　3　讨论?

　　研究表明，高向军等??[2]?采用二次展开，使化瘤颗粒中的三七皂苷R?1与人参皂苷Re在普通硅胶G板上达到分离，仅仅鉴别出化瘤颗粒中的三七。王晓坤等??[3]?采用液—液—液三相静态萃取法对人参、三七和西洋参药材样品进行预处理，然后对三相萃取物分别以不同的流动相梯度进行反相高效液相色谱法测定，对参类药材的复杂成分能进行有效分离，但未能鉴别出三者混合样品中的人参、三七和西洋参。翟为民等??[4]?用Polaris C??18??A，乙腈—水梯度洗脱，流速1?5?mL/min，检测波长203?nm，能有效单独鉴别人参、西洋参和三七，但不能鉴别出三者混合样品。董桂玲等??[5]?用薄层鉴别的方法分别鉴别出蛇胆Ⅱ号中的人参和三七的共有成分，但不能将两者区分开。由于人参和三七含有的成分相似，所知中的薄层鉴别方法仅能对复方中的人参或三七单独进行鉴别，而未能在复方中同时鉴别这两种名贵药材。?

　　本研究建立了在芪术调经散中同时鉴别人参和三七的方法。前期研究曾采用显微鉴别法观察芪术调经散粉末显微特征，但由于复方中干扰因素较多，且人参和三七显微特征极为相似而难以鉴别。也曾以正丁醇∶乙酸乙酯∶水(体积比为1∶1∶2，上层)??[6]?为展开剂，采用薄层色谱法对芪术调经散中人参和三七进行鉴别，结果表明，三七皂苷R?1和人参皂苷Re在此展开条件下不能有效分离。考虑到高效液相色谱法对结构相似的化学成分的分离效果好、灵敏度高，因此本研究采用高效液相色谱法对芪术调经散中人参和三七成分进行鉴别。结果表明此方法简便可行，能有效鉴别复方中人参和三七的特征化学成分。本方法的建立为其他复方中人参和三七的同时鉴别起到一定借鉴作用。??

【文献】
  　　[1]国家药典委员会? 中华人民共和国药典(一部)[S]?北京:化学出版社，2005：7，10??

　　[2]高向军，伍丕娥，刘挺松?化瘤颗粒的薄层色谱鉴别[J]?华西药学杂志，1999，14(5-6)：403??

　　[3]王晓坤，程秀民，唐辉，等?三相静态萃取高效液相色谱法鉴别人参、三七及西洋参[J]?药物研究，2007，16(20)：30??

　　[4]翟为民，袁永生，周玉新，等?人参、西洋参及三七参指纹图谱鉴别[J]?中药杂志，2001，26(7)：481??

　　[5]董桂玲，姜慧贞，闫吉冰?蛇胆Ⅱ号的薄层色谱鉴别[J]?山东医药工业，2003，22(3)：19??

　　[6]周漩，林乐明，张军?薄层色谱法分离人参皂苷的展开剂优化[J]?药物分析杂志，2001，21(1)：61?