草珊瑚离体不定丛芽诱导因子筛选的研究?
作者：潘见欢 潘超美 陈良坚 黄崇才 赖珍珍
【摘要】 【目的】 探讨影响草珊瑚不定芽诱导的培养因素，为建立草珊瑚初代离体培养体系提供依据。【方法】以草珊瑚下胚轴诱导获得的无菌再生苗茎段为外植体，考察6?苄氨基嘌呤(6?BA)和吲哚丁酸(IBA)不同浓度配比、光照时间和强度以及温度对草珊瑚离体不定芽高频诱导的影响。【结果】6?BA和IBA组合能有效提高草珊瑚不定芽的诱导率，而高浓度的植物激素会抑制草珊瑚不定芽的生长;草珊瑚在散射光或弱直射光照射下生长势头好，暗培养或过强直射光会出现植株发黄、皱缩、甚至死亡的现象;在温度为25?℃时，草珊瑚不定芽诱导率达到100?%，低于25?℃或高于30?℃均不利于其生长。【结论】以MS培养基为基本培养基，附加2?5?mg/L 6?BA+ 0?1?mg/L IBA，温度为25?℃，采用柔弱散射光或低于?2?000?lx?直射光照射，时间少于8?h能有效促进草珊瑚离体不定芽的诱导，诱导率达82?98?%。?
【关键词】 草珊瑚/生长和发育; 不定丛芽; 培养基，条件性?
草珊瑚?Sarcandra glabra?( Thumb?) Nakai ，属金粟兰科Chloranthaceae 草珊瑚属?Sarcandra?，又叫九节茶、肿节风、接骨木，为多年生草本或亚灌木。草珊瑚具消炎、清热、解毒和舒筋活血作用，临床用于多种炎症。最新研究发现草珊瑚对肿瘤，尤其是急性白血病有一定治疗效果??[1]?。近年来草珊瑚已被开发成一系列药品和日用品，如草珊瑚口服液??[2]?、草珊瑚清口香??[3]?和草珊瑚注射液??[4]?等。随着开发利用的不断扩展， 忽视了对其资源的保护，致使野生资源遭受毁灭性的破坏，因此挽救草珊瑚种质资源的研究势在必行。目前对草珊瑚的研究主要集中在常规栽培、药材的组织鉴别以及化学成分组成的分析上，在离体快速繁殖方面的研究甚少。本文在建立草珊瑚离体快速繁殖培养体系研究的基础上，对草珊瑚的离体丛芽诱导培养进行了多方面考察，旨在为肿节风药材生产的源头——草珊瑚优质种苗(试管苗)繁育的规模化、产业化生产奠定基础。现报道如下。?
1 材料与方法?
1?1 药材 试验药材采自广州帽峰山野生草珊瑚，经广州中医药大学药用植物学教研室潘超美教授鉴定，确认为金粟兰科植物草珊瑚?Sarcandra glabra?(Thumb?)Nakai。取其种子，经消毒后在无菌条件下诱导萌发，切取胚和下胚轴诱导获得无菌丛芽和再生植株，以无菌再生苗的茎段作为诱导不定芽的材料(图1)。
1?2 主要仪器与试剂 6?苄氨基嘌呤(6?BA)由上海求精生化试剂仪器有限公司生产(批号：20060718);吲哚丁酸(IBA)由上海求精生化试剂仪器有限公司生产(批号：20070310);琼脂粉由湛江新台兴海洋生物制品有限公司生产(批号：2007818);其他试剂均为化学纯;DL?CJ?1F型单人双面超净工作台由哈尔滨东联技术有限公司提供;YXQ SGD型全自动高压灭菌锅由广东医疗器械厂提供;XS125A型电子分析天平由瑞士Sartorius公司提供。LRH?300?G型生物光照培养箱由广东医疗器械厂提供。表1 丛芽诱导培养基的L??16?(4?5) 正交试验设计
1?3 多种影响因子的筛选??[5]? 采用MS培养基为基本培养基，培养基按照常规方法，根据表1正交试验设计的不同配方配制， 添加30?g/L的蔗糖、?6?g/L?琼脂粉，pH?5?8～6?0，121?℃～124?℃(1?1?kg/cm?2压力)灭菌15?min。在无菌条件下，将草珊瑚无菌再生苗切成1～1?5?cm长带节茎段，接种于培养基中，每瓶3～4个。培养温度(25±2)?℃，光照用日光灯1?800～2?200?lx，每天连续光照8?h。28?d后统计不定芽诱导率及不定芽的增殖率。?
2 结果与分析?
2?1 不同激素配比对草珊瑚丛芽诱导的影响 从表2结果可知，处理10和处理14均能获得较高的不定芽诱导率，即3?mg/L?6?BA+0?1?mg/L?IBA和2?5?mg/L?6?BA+0?1?mg/L?IBA的组合，在此激素组合水平下， 草珊瑚不定芽生长迅速，较粗壮，说明草珊瑚不定芽诱导阶段要求有较高的外源激素水平。但高含量的细胞分裂素(处理13~16)会在不定芽形成后，芽的基部膨大导致材料愈伤化。故不定芽诱导中以处理10组合较为合适。在两种激素的试验处理中，单独使用6?BA的量达3?mg/L(处理13)时，不定芽诱导率可提高到73?68?%，不定芽萌动时间提早，接种后15?d左右就会看到茎节处长出不定丛芽，但芽体较纤弱。?
图2结果显示，虽然6?BA、IBA和诱导率之间无明显线性关系，但在IBA浓度较低 (IBA=0、0?1?mg/L)时，随着6?BA浓度的增加，诱导率基本呈现增加的趋势，当6?BA为2?5?mg/L，IBA为0?1?mg/L时诱导率最高，达到82?98?%。当IBA浓度大于0?1?mg/L时，诱导率的变化波动较大。结合表2的直观分析表明，?R??A为0?219、?R??B为0?226，两种因子对丛芽诱导产生效应是IBA>?6?BA?，6?BA是影响不定丛芽分化的主要因子。
2?2 光照时间和强度对草珊瑚丛芽诱导的影响?
将草珊瑚无菌再生苗茎段接种到试验处理10的培养基中，置于光照培养箱中，温度设定为?25?℃?，考察不同光照时间和强度对草珊瑚丛芽诱导的影响，结果见图3、图4。在光照强度约为?1?800?～2?000?lx的直光培养中， 光照8?h的草珊瑚丛芽生长较快，植株生长迅速、叶片颜色深绿。但随着光照时间的增长，诱导率逐渐下降。此外，光照比放在培养箱中直光光照生长更迅速、丛芽诱导更好。而图4结果表明，光照强度对草珊瑚不定芽的生长有很大的影响，每增加2?000?lx，诱导率都降低10?%以上，在强光照下，草珊瑚不定芽生长变缓慢，叶片边缘发黄、皱缩，几乎不萌发出新芽，这一现象与草珊瑚的喜阴习性相符。?表2 不定芽诱导培养基的正交试验结果及直观分析
另外本实验也考察了黑暗中草珊瑚不定芽的生长情况，发现草珊瑚不定芽生长十分缓慢，甚至叶片边缘变黄、脱落，最终死亡，所以暗培养不适合用于草珊瑚茎段不定芽的诱导。?
2?3 温度对草珊瑚丛芽诱导的影响?
将草珊瑚茎段接种到试验处理10的培养基中，置于各温度梯度的光照培养箱中培养， 光照强度为1?800～2?000?lx，考察不同温度对草珊瑚丛芽诱导的影响。图5结果显示，草珊瑚对温度的变化十分敏感，在25?℃～30?℃的范围内诱导率最高，达到了100?%，大部分茎节均能较好地被诱导出丛芽，生长快速，植株健壮，但低于25?℃和高于30?℃诱导率均出现大幅降低的趋势，当温度达到40?℃时，全部组培苗变黄死亡。?
3 讨论?
植物体内外的激素含量对植株的生长发育起着重要的调控作用。在植物组织培养中，不同植物生长物质种类及其互相组合对促进植物外植体的组织分化十分重要。很多报道指出激素之间的相互作用比单独使用某种激素能取得更好的效果。周丽侬等??[6]?报道，单独使用萘乙酸(NAA)，香蕉外植体的增殖速度不高，而将NAA和6?BA 配合使用，可提高其增殖速度和数量。在本实验中也发现了草珊瑚对IBA较敏感，细胞分裂素类(6?BA)与生长素类(IBA)的共同作用，能显著提高对不定芽的诱导活性，促进草珊瑚不定芽的分化和增殖。单独使用6?BA，组培苗植株较细弱，丛芽生长缓慢，而加入了IBA后诱导率明显增高，但高浓度的IBA或组合高浓度的6?BA会抑制草珊瑚不定芽的生长，甚至出现愈伤化、植株矮化的现象。从表2的极差分析证实了这点，因素内水平极差(?R?值)的大小表明该因素对实验结果的影响程度，表2的结果表明IBA对不定芽诱导的影响大于6?BA。?
光照对离体不定芽生长的影响与植物物种的生长习性有关。美国芦荟??[7]?无菌苗在散射光光照条件下较为强壮，且繁殖率高，单层报纸遮光的条件下生根效果好，且无菌苗长势健壮，而强光照射容易灼伤幼苗。草珊瑚喜阴湿，适宜生长于郁蔽度为40%以上的山坡灌木或乔木林带下，在草珊瑚不定芽生长过程中同样表现出该特性，温度过高或过低以及强烈直射光均对草珊瑚不定芽的生长速度和强壮程度有抑制作用。?
采用正交实验进行多种影响因子的筛选，充分考虑各因子间的相互作用，研究结果具有实用性和可操作性。本试验针对诱导草珊瑚不定芽的激素组合、光照以及温度条件进行了初步的探讨，从结果可看出，诱导丛芽的最适合培养基为MS+2?5?mg/L?6?BA+0?1?mg/L IBA，温度为25?℃～30?℃，同时配合自然光照或柔弱直射光照8?h，短周期内可获得大量的草珊瑚不定丛芽(图6)，继代周期为35～40?d左右。本研究为今后草珊瑚的种质创新和规模化、工厂化种苗快繁生产奠定了基础。?
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[1] 王劲，杨锋，沈翔，等?肿节风抗肿瘤的实验研究[J]?浙江中医杂志，1999，10:450??
[2] 朱炳富，诸世远，王修性?草珊瑚口服液的制备及质量控制[J]?药业，2005，14(6):58??
[3] 宋莲珍，吴学慧，赵莲花?草珊瑚清口香的研制[J]?江西化工，2006，3:144??
[4] 郁建生?草珊瑚注射液临床疗效观察[J]?中国兽医杂志，2007，43(4):44? ?
[5] 李浚明?植物组织培养教程[M]?北京:北京农业大学出版社，1992:40??
[6]周丽侬，马雪筠，陈俊秋，等?香蕉通过胚状体途径快速繁殖的研究[J]?广东农业，1991，3:22??
[7]马春红，祝同娜?光照对美国芦荟组培苗生长的影响[J]?河北农业科学，2002，3(6):11?
