大孔吸附树脂纯化贯叶连翘总黄酮工艺研究
【摘要】 目的 研究大孔吸附树脂分离和纯化贯叶连翘总黄酮的工艺条件。方法 以总黄酮的吸附量和解吸率为考察指标，对4种不同类型的树脂进行评价。结果 AB?8型大孔吸附树脂对贯叶连翘中总黄酮具有较好的分离能力。结论 采用本法分离纯化贯叶连翘总黄酮简单可行。
【关键词】 贯叶连翘； 总黄酮； 大孔吸附树脂； 纯化
【Abstract】 Objective To obtain the optimal conditions for separating the flavonoids from the extract of Hypericum perforactum L. by selecting appropriate macroporous absorption resins..Methods Separating efficiency of four types of macroporous absorption were evaluated by measuring the absorption ratio and eluting ratio of flavonoids. Results The AB?8 macroporous absorption resin had better separating efficiency. Conclusion This method is simple,feasible and suitable for industry production.
【Key words】 Hypericum perforactum L.；flavonoids；macroporous absorption resin; purification
贯叶连翘（Hypericum perforatum）属金丝桃属藤黄科多年生草本植物，全草可入药。这种野生植物的全草或带根全草有药用价值。贯叶连翘具有清热解毒、收敛止血、利湿等功效，主要用于止血、抗炎、妇科病等。目前，用贯叶连翘提取物制成的制剂已在欧美大量上市，用于治疗抑郁症、甲型和乙型肝炎及艾滋病等。此外，还有报道其有抗肿瘤活性。贯叶连翘含有多种具有生物活性的化学成分，不同成分具有不同的药用价值，成分相互之间发挥协同作用从而用于不同疾病的治疗。因此，分离纯化贯叶连翘总黄酮具有重要意义。
大孔树脂物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长，现已广泛应用于天然产物的分离和富集。但大孔吸附树脂型号很多，性能用途各异，因此本文特选了四种不同型号的大孔树脂，从中筛选出分离纯化效果最好的树脂种类。
1 试药
贯叶连翘（购于五块石中药材市场）；AB?8、 D101、 NKA、 D4020大孔吸附树脂，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 总黄酮含量的测定
2.1.1 最大吸收波长的选择 精密量取标准品溶液各1 ml分别置25 ml容量瓶中,其余操作均同标准曲线制备，在紫外?可见光分光光度计下400～700 nm 处扫描，标准品最大吸收波长511.3 nm，样品液最大吸收波长为510.5 nm，综合上述实验拟定510 nm为检测波长。
2.1.2 标准曲线的绘制 精密量取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品12.5 mg置25 ml量瓶中，加一定浓度的甲醇适量，超声30 min使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，准确吸取20 ml置于25 ml容量瓶中，加水至刻度，即得0.4 mg/ml 的标准品溶液。精密量取上述芦丁标准品溶液0 ml、 1 ml、 2 ml、 3 ml、 4 ml、 5 ml、 6 ml分别于7支50 ml容量瓶中，编号，各加水至6 ml，加入1ml 5% 亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加入1 ml 10% Al(NO3)3 溶液，摇匀，放置6 min，后加入4.3%的NaOH溶液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以0号容量瓶为空白试剂，照紫外?可见分光光度法（《药典》2005年版一部附录VA），在波长510nm处测定吸光度（结果见表1）。表1 各样品液吸光度表以吸光度A和浓度C进行回归，得线性回归方程为：C= 0.093 0A+0.000 2，r=0.999 83，线性范围0.008 mg/ml～0.048 mg/ml.
2.2 样品溶液的制备
药材的取样：因为贯叶连翘是全草入药，且在各个部位的总黄酮的含量不一致，为使取样均一性且保证其全草入药，故将其分为枝和叶两部分分别粉碎干燥，混匀后称取，以消除取样带来的误差。
贯叶连翘中黄酮的提取：选用4种方法提取贯叶连翘中的黄酮，分别是：乙醇回流提取法、碱液提取法、超声提取法、渗漉法。由实验结果得碱提效果最佳，后进行碱提提取条件的考察，包括碱水量、提取次数、碱水浓度、提取时间，从而确定最佳提取工艺，得到黄酮的提取液。
2.3 静态吸附实验
2.3.1 树脂预处理 树脂先用乙醇充分溶胀，然后用乙醇洗至流出液加适量水无白色浑浊现象，再用去离子水洗尽乙醇至无味即可。
2.3.2 树脂的筛选 吸附率的测定：精密称取处理好的树脂2 g，分别置120 ml磨口三角瓶中，将样品液（样品原液浓度0.076 46 mg/ml，吸光度0.820）过滤，分别精密加样品液50ml，静置24 h，充分吸附后，取上层液，过滤，先吸取滤液0.1ml，测得吸光度为0.013，因吸光度在0.3～0.7之间稳定性较好，故初选设定各吸取1ml，测得吸光度（结果见表2）。表2 各树脂吸光度表吸附率 s=（Po?Pa）/Po. 式中：Po为样品溶液中总黄酮的初始浓度（mg/ml），Pa为吸附平衡后溶液中总黄酮浓度（mg/ml），由此得到各树脂的吸附率（结果见表3）。表3 各型号树脂吸附率由吸附率可得，相同条件下AB?8 吸附最高。
洗脱率的测定：滤出饱和吸附的树脂，分别精密加入95%乙醇50 ml，在温度为20 ℃，震荡频率为100 Hz条件下，洗脱1.5 h，待其树脂颜色基本恢复白色后，将洗脱液过滤后各吸取3 ml，测定吸光度（结果见表4）。表4 各型号树脂洗脱液吸光度 解析率 D=Pd×Vd／（Po?P1）×Vo×100。式中：P0为吸附前供试样液中黄酮的质量浓度（mg／ml)；Pl为吸附平衡时上清液中黄酮的质量浓度（mg/ml）；Vo为样液的体积（ml）；Pd为解吸液中黄酮的质量浓度（mg/ml）；Vd为解吸定容的体积（ml）。由公式得到各树脂型号解吸率（结果见表5）。表5 各型号树脂解析率由表6得，相同条件下AB?8的解析率最高。
上述结果表明，4种树脂中AB?8具有较好的静态吸附效果及解析效果，吸附率高于其他3种树脂，故在本次实验中选择AB?8 型树脂来纯化和富集贯叶连翘中黄酮类成分。
2.3.3 洗脱剂浓度的选取 分别精密选取2 g处理好的AB?8型树脂5份，分别置带塞锥形瓶中，各加样品液20 ml，静置24 h，待充分吸附后，分离出树脂，用蒸馏水冲洗掉上面残余的样品液，将树脂晾干，置于5个烧杯中，分别加入浓度为30%、 45%、 60%、 80%、 95%乙醇各20 ml，在温度为20 ℃，震荡频率为100 Hz条件下，洗脱1.5 h，将洗脱液过滤，分别吸取10 ml，在510 nm下测吸光度（结果见表6）。 表6 洗脱剂浓度筛选结果
可见，在一定范围内，随着乙醇的浓度增加，吸光值随之增加，当乙醇的浓度达到60％时，吸光值达到最大值，因此，选用60％的乙醇进行洗脱。
2.4 动态洗脱曲线的研究
2.4.1 树脂的装柱 在玻璃柱底垫上少许棉花，压上小块平整的碎石，慢慢将处理好的树脂10ml倒入玻璃柱，以防棉花被冲起，保持蒸馏水液面高出树脂一小段距离，关闭玻璃柱出口。
2.4.2 样品液的上柱 取过滤过的样品液一定量，沿着玻壁缓缓倒入柱筒，等样品液完全浸透树脂，柱筒出口有少量样品液流出时，关闭出口，静置过夜。
2.4.3 树脂的洗脱 打开树脂柱筒出口，样品液流出后，加入蒸馏水冲洗，待洗出液无色即可，保持树脂湿润。配置60%乙醇溶液200 ml，对树脂进行洗脱，控制流速为1 ml /min，分段收集洗脱液，每7 ml收集1份，直到洗脱液基本无色。共收集14份，用去乙醇100 ml，测得各份吸光度（见表7）。以每份流出液体体积为横坐标，相应吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线（见图1）。表7 洗脱剂用量筛选由图1可得，在第三份洗脱液，即洗脱剂体积为3BV的时候，吸光度值最高，即黄酮含量最高，故洗脱剂体积选用3倍柱体积。
3 结 论
不同类型大孔吸附树脂对同一有效成分的吸附能力有差异，本试验对D101、D4020、NKA、AB?8,四种型号的大孔吸附树脂进行了筛选,以大孔吸附树脂的吸附容量及洗脱率为指标, 最终确定AB?8型大孔吸附树脂为贯叶连翘中黄酮的分离树脂。另外，通过对洗脱剂浓度和剂量的考察，确定最佳洗脱剂为浓度60%的乙醇，最佳洗脱剂剂量为3BV。
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