白术茯苓汤调控脾虚大鼠血管活性肠肽总多糖的提取工艺研究

                作者：彭腾 贾波 彭成 文跃强 宴永明 张楠 贺小芳 

【摘要】  目的 研究白术茯苓汤总多糖的提取工艺。方法 通过单因素实验及正交实验确定提取总多糖的优化条件,用分光光度法测定总多糖的含量。结果 白术茯苓汤总多糖提取的最佳条件是：料液比为1∶30、提取时间为2.0 h、提取次数为3 次、温度90 ℃.在此条件下测得白术茯苓汤中总多糖含量为48.25 mg/g.结论 该方法简便、快速、准确,适用于该复方中总多糖的含量测定。

【关键词】  白术茯苓汤； 总多糖； 正交实验； 含量测定

    【Abstract】  Objective To investigate the extraction process of polysaccharide from Atractylodes Poria soup.Methods The optimal condition was determined by the orthagonal experiment and single?factor test. Polysaccharides were measured by spectrophotometry. Results Experiment reveals that optimal condition for extraction was as follows: temperature: 90℃; duration: 2 hours; times: 3 times; ratio: 1:30(w/v).The volume of polysaccharides in Atractylodes Poria soup is 48.25 mg/g. Conclusion The method is simple, rapid and accurate for determination of polysaccharide from the compound.

    【Key words】  Atractylodes Poria soup;  polysaccharide;  orthogonal experiment; determination

    脾气虚证是中医临床常见征候，病变涉及到消化吸收功能障碍、自主神经功能紊乱、内分泌功能失调、免疫功能低下，以及血液系统、运动系统和能量代谢等方面的诸多异常。其中，脾气虚证内分泌激素尤其是胃肠道激素分泌异常是近年来研究的重要内容。白术茯苓汤由白术、茯苓组成，二药配伍运用，始见于张仲景所著《伤寒杂病论》，该方是在“经方配伍的研究”中发掘整理出的脾胃气虚证、脾虚湿滞证、肝脾不和证等的经典配伍。课题组前期研究结果表明，白术茯苓汤水煎剂能显著下调SD大鼠脾虚动物血管活性肠肽含量的升高［1?2］。文献报道［3］，白术中多糖和挥发油是白术发生药效的重要物质基础之一；而茯苓中所含的多糖是健脾的重要活性部位［4］。药效学筛选进一步显示，白术茯苓汤水煎液总多糖为调控脾虚大鼠血管活性肠肽的有效部位之一(另文发表)。本文采用单因素试验和正交试验相结合探索白术茯苓汤总多糖的最佳提取工艺，为深度开发该复方提供依据。

    1  试药

    白术(Rhizoma atractylodis macrocephalae)、茯苓(Wdfiporia COCos(Schwein．)Ryvarden&Gilb)药材饮片均购自成都市五块石药材综合市场，并由成都中医药大学卫莹芳教授鉴定。

    2  方法

    2.1  多糖的测定方法

    2.1.1  测定波长的选择  精密吸取葡萄糖标准液0.60 ml置10 ml容量瓶中, 加水补足2 ml，用标准曲线的测定方法显色后, 以试剂空白为参比, 从370～520 nm 每隔5 nm 测定一次吸光度, 结果测得在490 nm处吸光度最大, 所以选择测定波长为490 nm.

    2.1.2  标准曲线的制备  准确称取0.005 0 g葡萄糖标准，以蒸馏水溶解定容至100 ml，得到50 μg/ml的葡萄糖标准溶液。分别吸取0.1 ml、0.2 ml、  0.3 ml、  0.4 ml、  0.5 ml、  0.6 ml葡萄糖标准液并以蒸馏水补足2 ml，各加入1 ml 5%苯酚水溶液，摇匀后，分别加入5 ml浓硫酸，混合均匀并于室温放置20 min后，在490 nm处测吸光度，以蒸馏水代替糖溶液作空白，求得葡萄糖标准曲线的回归方程A490=0.023X+0.010 6， R2=0.999 8（见图1）。

    图1  葡萄糖标准曲线

    Fig.1  Standard curve of glucose

    2.1.3  白术茯苓汤总多糖的提取与精制  取白术、茯苓按临床配比混合均匀后, 精密称取样品粉末5 g置提取装置中，先以石油醚(60 ℃～90 ℃)回流除去脂类(1 h)， 加入90%的乙醇200 ml，在85 ℃下回流,浸提2次，每次2.0 h，目的是除去北沙参中的单糖、低聚糖、苷类等醇溶性成分［5］。药渣挥去溶剂后,用水提取多糖, 提取液在50 ℃经减压浓缩至原体积的1/3, 浓缩后水溶液中加入4倍量的95%乙醇, 静置过夜，抽滤， 沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤多次，60 ℃烘干至恒重, 即得白术茯苓汤总多糖。

    2.2  多糖的提取方法

    2.2.1  单因素实验

    2.2.1.1  料液比的选择  称取白术、茯苓按临床配比（1∶1）0.500 g经石油醚回流处理的药材15份，分别按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液比加入水，于水浴90 ℃提取50 min，过滤，定容至100 ml，备测。

    2.2.1.2  提取时间的选择  称取白术、茯苓按临床配比（1∶1）0.500 g经石油醚回流处理的药材15份，加入20 ml水，于水浴90℃分别提取1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，过滤、定容至100 ml，备测。

    2.2.1.3  提取温度的选择  称取白术、茯苓按临床配比（1∶1）0.500 g经石油醚回流处理的药材15份，加入20 ml水，分别在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90℃、100 ℃提取30 min，过滤、定容至100 ml，备测。

    2.2.2  白术茯苓汤总多糖提取的最佳组合的选择以1: 30 为料液比, 根据药材性质，拟定影响浸出效果的3 个主要因素A(水浴温度)、B(提取时间)、C(提取次数)为优选因素，每个因素3 个水平选用L9 (34 )正交表进行实验(见表1) ，进一步探索最佳提取参数。表1  因素水平表

    3  结果

    3.1  料液比对白术茯苓汤总多糖含量的影响

    由图2可看出,料液比在1∶10～1∶50之间,从1∶10～1∶30多糖含量随料液比的增加而增加,料液比为1∶30时含量最高,而当料液比为1∶40～1 ∶50 时,提取的多糖含量随料液比的增大趋于稳定。

    3.2  提取时间对白术茯苓汤总多糖含量的影响

    由图3可看出,提取时间在2 h以内,多糖含量随着时间的延长而增加；当提取时间大于2 h,多糖含量变化趋于稳定。因此,提取时间以2 h为最理想。

    3.3  提取温度对白术茯苓汤总多糖含量的影响

    从图4可知,当温度在60～90℃时,多糖含量随着温度的升高而增加;当提取温度为90℃时,多糖含量出现最大值;而当温度大于90℃时,多糖的含量变化不显著。

    3.4  不同的提取条件组合对白术茯苓汤总多糖含量的影响

    由表2 直观分析可知, 5号实验结果最好, 对应的优化组合为A2B2C3; 由极差R 分析可知, 多糖提取条件因素的主次顺序为B>A>C, 即温度>提取时间>提取次数。 而由正交条件的均匀可比性得知, 各因素的好水平组合起来就是最优水平组合, 即A2B3C2综合优选。实验验证，结果A2B2C3条件下提取的多糖含量为48.40 mg/g.多糖得率为35.21%.A2B3C2条件下提取的多糖含量为48.25 mg/g，多糖得率为35.14%，两者并没有显著性差别，综合考虑到节约人力和大生产的需要，故最优秀条件选择A2B3C2，即是料液比为1∶30、温度为 90 ℃、提取时间为2 h、提取次数为3次。  表2  正交试验设计与结果表表3  方差分析表

    4  讨论

    本文所采用的单因素试验结合L9(34)正交试验方法，以水提取白术茯苓汤总多糖;白术茯苓汤总多糖提取的最佳工艺参数为：料液比为1∶30、温度为90℃、提取时间为2.0 h、提取次数为3 次。在此条件下, 白术茯苓汤总多糖含量最高达到48.40 mg/g.

    在对多糖和低聚糖的含量进行测定时，多糖和低聚糖在强酸溶液中水解成单糖，戊糖和己糖发生脱水环化，形成呋喃甲醛类化合物，它们能与多酚等试剂形成有色物质，利用这一性质，对白术茯苓汤中的总多糖含量进行了测定。多糖的含量测定有蒽酮?硫酸法、DNS法、苯酚?硫酸法等。苯酚?硫酸法与其它方法相比，具有简便、快速、灵敏、显色持久的优点，能有效地应用于白术茯苓汤中总多糖的含量测定。

    　　［6］的方法，比较了采用水煎煮、稀碱浸提茯苓中的多糖，多糖的含量并没有实质性的提高，同时药理实验也显示碱提法不能显著下调SD大鼠脾虚动物血管活性肠肽含量的升高。白术茯苓汤总多糖能显著下调SD大鼠脾虚动物血管活性肠肽含量的升高，其多糖的结构有待进一步的研究。

【参考文献】
  ［1］ 贾 波，邓中甲，黄秀深，等. 白术茯苓汤及基础伍对膜虚大鼠胃肠激素的影响［J］.成都中医药大学报，2002，25（2）：13?15.

［2］ 魏 华，贾 波，张平华，等. 白术茯苓汤分煎、合煎及醇提对脾虚大鼠血管活性肠肽的比较研究［J］.中药药理与临床，2007，23（5）：37?38.

［3］ 刘思贞，邵玉芹，祝希娴. 白术药理研究进展［J］.时珍国医国药，1999，10（8）：634.

［4］ 张兵影，薛志强，邓建新，等. 茯苓健脾作用活性部位的研究［J］.菌物研究，2007，（5）：110?112.

［5］ 孟协中，席金萍，李力平，等. 枸杞多糖化学研究的现状［J］.宁夏农林科技, 1999, (4) : 22?25.

［6］ 周燕霞，唐明林，殷辉安，等. 茯苓中多糖的提取及含量测定［J］.天然产物研究与开发，2003， 15（4）：330?333.