清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒黏附、膜融合影响的实验研究

                  作者：袁斌  廖辉 汪受传 徐建亚 李华丽 李江全

【摘要】  目的 研究清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒黏附、膜融合过程的抑制作用。方法 应用温度转换的方法，在病毒黏附阶段（温度转换前）和病毒侵入阶段（温度转换后）分别加入清肺口服液含药血清，监测两个阶段病毒抑制率和平均吸光度(A)值，观察研究清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒黏附和膜融合的影响。结果 温度转换实验前，含药血清组平均A值与病毒对照组无显著性差异；病毒侵入阶段（温度转换后）的清肺口服液含药血清组病毒抑制率为增多，平均A值明显升高。温度转换实验前后差异有统计学意义。结论 清肺口服液含药血清的抗病毒作用主要表现在呼吸道合胞病毒黏附后的膜融合及侵入阶段。

【关键词】  清肺口服液/血清学； 呼吸道合胞病毒/中医药疗法； 清热解毒剂； 实验

    【Abstract】  Objective  To study the inhibition effects of Qingfei oral liquid medicine?contained serum on adhesion and membrane fusion process of respiratory syncytial virus. Methods  Using the method of temperature conversion，we added Qingfei oral liquid medicine?contained serum during adhesion period(before temperature conversion) and invasion period(after temperature conversion) respectively.Monitor virus inhibition rates and average A of the two periods，observe the influence of Qingfei oral liquid medicine?contained serum on adhesion and membrane fusion process of respiratory syncytial virus. Results  No significant differences were found on the average A between Qingfei oral liquid medicine?contained serum group and virus control group before temperature conversion experiment.After the temperature conversion，virus inhibition rates of Qingfei oral liquid medicine?contained serum group increased，the average A increasing obviously.Differences were significant before and after temperature conversion experiment. Conclusion  The antiviral effect of Qingfei oral liquid medicine?contained serum mainly embodies on the membrane fusion and invasion phases  after adhesion process of respiratory syncytial virus.

    【Key words】  Qingfei oral liquid/Serology；  RSV/TCM therapy；  Heat?clearing and detoxifying agents;  Expertimental

    呼吸道合胞病毒(Respiratory syncyntial virus，RSV)是婴幼儿下呼吸道感染最常见的病毒病原［1］。是老年人和免疫抑制患者呼吸道疾病的重要病原［2］，西医对其尚无理想措施。清肺口服液(由炙麻黄、苦杏仁、生石膏、黄芩、葶苈子、炙桑白皮、前胡等组成)为江苏省中院内制剂，广泛应用于临床治疗小儿呼吸道合胞病毒肺炎，疗效较好，前期相关研究也表明，清肺口服液含药血清对RSV有抑制作用［3］，但这种抑制作用的具体环节尚未得以阐明。为此，本研究从病毒的微观组织结构和黏附侵入靶细胞阶段过程的角度出发，设计进行温度转换实验研究。现将研究结果报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料  呼吸道合胞病毒A亚型（Long株，广州博特生物工程有限责任公司)；Hep?2（人喉癌上皮细胞，布克生物技术有限公司)；DMEM（美国GIBCO公司）；新生牛血清（杭州四季青公司）；0.25%胰酶（美国GIBCO公司）；MTT（美国AMRESCO公司）；DMSO(上海永华特种化学试剂厂)；酶标仪（美国BioTek公司）。

    1.2  Hep?2细胞  培养Hep?2细胞采用含10%小牛血清的DMEM培养液，35 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱饱和湿度下常规培养。镜下观察细胞呈不规则多角形，生长状态良好的细胞每2～3 d传代，0.25%胰酶消化2 min，镜下观察细胞回缩变圆时停止消化，每次分3～4瓶。所有实验均采用对数生长期细胞。

    1.3  呼吸道合胞病毒液制备及组织培养半数感染量（TCID50）的测定［4］  Hep?2细胞以1×108/L接种25 mL培养瓶，每瓶3 mL。将长成单层细胞的培养液倒掉，接种病毒液，吸附1.5 h。加入适量含2%小牛血清的维持液，继续培养3～5 d。待细胞80%产生病变后，置-80 ℃（至少2 h）和37 ℃反复冻融3次。离心管离心10 min，2 500 r/min。弃沉淀，收集病毒上清液，分装后于-80 ℃保存备用。Hep?2细胞以1×108/L接种96孔培养板，每孔100 μL。病毒液用维持液10倍系列稀释8个浓度。细胞长成单层时吸弃培养液，磷酸盐缓冲溶液洗细胞面，接种各稀释度的病毒液，并设正常细胞对照组。置35 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中吸附2 h，15 min摇晃1次，使病毒均匀吸附。吸弃病毒液，每孔加维持液100 μL，置培养箱中继续培养，逐日观察病变程度并记录。以最高稀释度不再出现新病变时为终点，用Reed?Muench公式病毒TCID50。

    1.4  含药血清和利巴韦林对细胞最大无毒浓度测定  Hep?2细胞以1×108/L加入96孔细胞板，每孔100 μL，待长成单层后，加入维持液稀释后的清肺口服液含药血清，每孔100 μL，并设正常细胞对照。置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，观察细胞病变至72 h。弃去上清液，用移液器每孔加入MTT（1 g/L）100 μL。置孵箱孵育4 h。吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 100 μL，振荡，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，用酶标仪测定各孔平均吸光度(A)值，确定药物的最大无毒浓度。

    1.5  温度转换实验  Hep?2细胞以1×108/L分种于96孔板，100 μL/孔，共种2板。待细胞生长至80%汇合，将板置4 ℃ 30 min。其中一板吸弃培养液，加入TCID50 RSV，细胞对照加冷DMEM，50 μL/孔。4 ℃孵育2 h，每隔15 min摇晃1次，使病毒均匀吸附。吸弃病毒液，2%维持液洗2遍。加入2%维持液稀释的清肺口服液含药血清（10 g/L），细胞对照加DMEM，100 μL/孔，每组设8个复孔。置35 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱孵育1.5 h。吸弃上清，预热的2%维持液洗2遍，加2%维持液150 μL/孔，35 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱继续培养。每日观察细胞病变并记录，待病毒对照出现典型病变时测定A值。另一板4 ℃时将病毒和含药血清同时加入，并设细胞对照。4 ℃吸附2 h。吸弃药物及其中的病毒，2%维持液洗2遍，加2%维持液150 μL/孔。35 ℃、体积分数为0.05的CO2孵箱继续培养。每日观察细胞病变并记录，待病毒对照出现典型病变时测定A值。病毒抑制率=（实验组平均A值-病毒对照组平均A值）/（细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值）×100%。

    1.6  统计学处理  数据计量资料采用±s表示，两组比较用t检验。

    2  结果

    2.1  含药血清对Hep?2细胞最大无毒浓度  在Hep?2中，清肺口服液含药血清的最大无毒浓度为10 g/L。

    2.2  呼吸道合胞病毒RSV?Long株TCID50  在Hep?2中，RSV?Long株TCID50为10-4.625/50 μL。

    2.3  温度转换实验结果  温度转化前病毒抑制率为150%，温度转化后为1 142%。见表1。表1  3组温度转换前后平均吸光度值的比较 注：与病毒对照组比较，aP＜0.05。

    3  讨论

    RSV属副黏病毒科肺炎病毒属，是有包膜的非节段性单股负链RNA病毒。RSV病毒表面由融合蛋白(F)、黏附蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)3个跨膜蛋白组成，共同参与病毒外膜与宿主细胞膜胞的融合以及细胞培养过程中合胞体的形成；F蛋白与病毒进入细胞并形成特征性的合胞体有关，还具有促使RSV在感染细胞间传播及溶血的作用［5］。有研究认为F蛋白介导病毒与受染细胞间的膜融合作用，在病毒感染过程是必需的［6］。和其他病毒一样，呼吸道病毒和宿主细胞的结合是病毒进入感染靶细胞的前提条件。多数病毒在0～4 ℃低温下发生结合，而仅在接近生理温度下才侵入细胞。这是因为与病毒黏附不同，有包膜的病毒的侵入是通过膜融合完成的，这一过程需要能量，而所需能量只有在生理温度下才能得到供给。

    本实验在病毒黏附阶段（温度转换前）加入清肺口服液含药血清，检测平均A值与病毒对照组无显著性差异；在病毒侵入阶段（温度转换后）加入清肺口服液含药血清，病毒抑制率为1 142%，平均A值明显升高，靶细胞受到保护，提示该药没有直接影响病毒与靶细胞的黏附，其作用发挥主要在阻止病毒的膜融合及侵入。提示清肺口服液对呼吸道合胞病毒的作用位点可能是与此病理过程紧密相关的病毒表面F蛋白。清肺口服液可能在感染的早期运用疗效更好。病毒生物分子学的研究也提示，对F蛋白结构的深入了解，可以提供研制相关病毒抑制药物作用靶位点的线索，进而可以阻碍F蛋白构象的改变，防止其功能性结构的形成，从而阻断病毒与细胞的融合这一环节，达到抑制病毒增殖的目的。现代药实验研究表明，中医药疾病的疗效往往通过多环节多靶点的共同作用实现，将从含药血清对细胞的微观结构改变影响的角度进一步探讨其共同作用机制。

【】
  ［1］ Hall CB.Respiratory syncytial virus：a continuing culprit and conundrum［J］.J Pediatr，1999，135(2 Pt 2)：227.

［2］ Falsey AR，Walsh EE.Relationship of serum antibody to risk of respiratory syncytial virus infection in elderly adults［J］.J Infect Dis，1998，177(2)：463?466.

［3］ 汪受传，王霖，陈超，等.清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒抑制作用的实验研究［J］.南京中医药大学学报（版），2008，24（1）：25?26.

［4］ 傅继华.病毒学实用实验技术［M］.济南：山东科学技术出版社，2001：60?64.

［5］ Kumar M，Behera AK，Lockey RF，et al.Intranasal gene transfer by chitosan2 DNA nanospheres protects BALBPc mice against acute respiratory syncytial virus infection［J］.Hum Gene Ther，2002，13(12)：1415?1425.

［6］ Karron RA，Buangurio DA，Georgin AF，et al.Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro：clinical evaluation and molecular characterization of a cold?passaged，attenuated RSV subgroup B mutant［J］.Proc Natl Acad Sci，1997，94（13）：961?966.