胆囊恶性肿瘤的分子生物学研究进展
胆道系统恶性肿瘤包括胆囊癌和胆管癌。以往曾认为胆道癌为罕见疾病，但是近年来胆道肿瘤发病率有明显上升趋势。胆道癌出现临床症状多属晚期，疗效差，预后不佳。因而对其发病机制的探讨和早期诊断研究正日益引起人们重视。八十年代后期以来，癌基因和抑癌基因的研究成为肿瘤研究的热门课题，有希望为恶性肿瘤的诊断和提供一条全新途径。胆道肿瘤的基因研究也逐渐得到人们的关注。
迄今为止已发现和胆道肿瘤有关的癌基因有Ras（K－ras，N－ras）、c－myc、c－erbB－2、某些细胞因子及其受体、抗癌基因有P53、P16／MTS1、APC、DCC等。
1 癌基因
ras基因是一个常见的癌基因家族，由K－ras，N－ras，和H－ras三个成员构成［1］。细胞中正常ras基因编码高度相关的分子量为21000的蛋白质（P21）。P21是一种鸟嘌呤核苷酸（GTP）结合蛋白，它由188或189个氨基酸组成，和细胞生长和分化密切相关。正常P21和GTP结合后激活磷脂酶C，产生第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG），之后GTP被P21降解，第二信使便执行使细胞分化和生长功能。若正常的ras基因发生了突变而变成了癌基因，其所编码的变异P21蛋白仍能同GTP结合但是失去了降解GTP的功能，从而使磷酸脂酶C持续活化，产生大量IP3和DG，引细胞过度增殖，最终发生癌变［1］。
现在已在人类多种肿瘤中检测到了ras基因突变［1］。40％的结肠癌，50％的肺腺癌，30％的急性白血病中均可检测到ras基因的突变。其突变的作者单位：医科大学第二临床学院肝胆外科（沈阳110003）崔健现在上海医科大学中山肝癌研究所（200032）主要方式是点突变，12、13、61密码子是突变热点。在胰腺癌中K－ras基因的突变率高达90％以上，而且突变的位点大多局限于K－ras基因12位点上［2］。但是对于胆系肿瘤，关于ras基因突变研究极少，而且结果差异很大，甚至还有完全相反的报道［3～5］。
almoguera应用RNA酶错配切割法和DNA直接测序，分析胆道肿瘤的病理标本时，未见任何ras基因改变［2］。而Tada等应用DNA测序法研究胆囊癌和胆管癌标本发现肝外胆管癌中偶有ras基因突变，在胆囊癌中则不存在ras基因改变［3］。与之相反，Levi等的研究结果表明胆系肿瘤中存在着广泛ras基因点突变［4］。他们认为以往文献所报道的胆系恶性肿瘤中K－ras基因低突变率的原因不在于肿瘤细胞中真的不存在K－ras基因改变，而是检测方法灵敏度不够所致。DNA直接测序时，大约需要20％的细胞发生突变才能得到阳性结果，而RNA酶寡核苷酸错配切割法的灵敏度则更低。他们认为，由于胆道肿瘤是多克隆发病，因而发生K－ras基因突变的细胞只是一小部分，用常规的实验方法难以检测出来。他们应用改良的两步PCR－RFLP法（两轮碱基错配PCR＋两轮限制性核酸内切酶酶切）配以DNA直接测序，发现肝外胆管癌中K－ras基因突变率为100％。这种方法灵敏度非常高，可以在512个等位基因中检测到一个基因的点突变。
watanabe等应用与Levi类似但更为简便的方法检测了20例胆道肿瘤的标本［5］。结果发现55％的胆囊癌、100％的肝外胆管癌均存在K－ras基因改变。总的突变率为75％。绝大多数突变发生在第12位密码子。常见的突变方式是G→A，使GGT变成了GAT，所编码的氨基酸也随之由甘氨酸变成了天冬氨酸。少部分发生GGT→GTT及GGT→TTT改变，这些都导致了相应氨基酸改变，因而均是有意义突变。更为重要的是，他们发现一例胆囊腺瘤癌变的标本中，表面正常的腺瘤已经发生了K－ras基因突变，而且突变方式和癌组织完全一样，从而在基因水平上支持了胆囊腺瘤癌变的理论。
ajiki等的研究亦表明K－ras基因突变是胆道肿瘤中的一种普遍现象［6］。在他们的研究中，胆囊癌、胆管癌、胆囊上皮不典型增生的K－ras基因12位点的点突变率分别为57％、59％、73％。他们的实验也发现了一个很有意义的现象：9例发生在胆囊癌周围的不典型增生，都表现出了和胆囊癌相同的突变。因此他们认为在某些致癌因素（如：胆石、长期胆汁酸刺激等）的作用下，胆囊粘膜肠上皮化生→胆囊粘膜不典型增生→胆囊癌是胆囊癌的发病机制之一。
yukama 等应用免疫组织化学方法研究了慢性胆囊炎、早期胆囊癌和进展期胆囊癌中ras基因和其他癌基因产物的表达。发现早期胆囊癌中ras基因产物P21阳性表达率高达95％。胆囊炎为33％。其他癌基因产物如c－myc、c－erbB2、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子受体（TGF－β）等在胆囊癌都有高表达，平均阳性率在60％左右。而在慢性胆囊炎中它们表达阳性率较低，平均在10％以下［7］。Lee等的研究结果也表明，与胆囊不典型增生和慢性胆囊炎相比，胆囊癌中P21呈现强表达，阳性率为62％，胆管癌中P21阳性率也达到了50％。P21表达和预后没有明显的关系［8］。以上学者都认为：胆囊癌发病过程中存在着多种基因共同作用，其中，ras基因突变可能是早期发生的事件之一。这与ras基因突变在结肠癌发病中的作用是类似的［9］。
c－erbB2癌基因所编码产物是一种表皮生长因子受体（EGFR）类似物。对于它的研究结果不尽相同。Kamel等的研究结果表明胆囊癌中c－erbB2·35·肝胆胰外科杂志1999年第11卷第1期阳性率大约为10％。胆囊粘膜不典型增生中，其阳性率为0。他们认为c－erbB2表达在胆囊癌中是一较晚事件，只有在细胞癌变后才出现［10］。而Yukama等的研究表明c－erbB2在早期胆囊癌中阳性表达率为69％。在进展期胆囊癌中表达率为0。他们认为c－erbB2癌基因突变是胆囊癌发生早期事件之一［7］。出现这一不同结果的原因可能是：1．他们采用的方法、技术和对阳性率的规定不同。2．所选择的胆囊癌是由完全两种不同的致癌因素造成的。因此关于c－erbB2在胆囊癌发生中到底起何种作用，仍需进一步研究。
2 抑癌基因
关于抑癌基因，目前研究最多的是P53基因。P53定位于人染色体17P13，全长为16－20Kb，由11个外显子构成。正常P53基因编码野生型P53蛋白，是一种分子量为53KD的核内磷蛋白。人的P53蛋白由393个氨基酸组成。P53基因突变后所编码的蛋白称为变异型P53。
在人乳腺癌、脑瘤、结直肠癌、食管癌和肺癌中均已发现P53基因突变，总突变率为50％左右［11～13］。其中83％为错义点突变，6％为无义点突变，10％为插入或缺失突变。P53的突变并非随机发生，大多数的突变发生于133－299氨基酸。应用PCR技术研究后发现密码子132－145、171－179、239－248、272－286为突变热点。
野生型P53蛋白的主要功能是：抗细胞增殖，抑制细胞生长分裂，使细胞停止于G1期而不进入S期。野生型P53可以阻碍DNA复制起始复合物的装配，抑制DNA复制，并且在转录水平进行调节，防止细胞过度生长分裂。此外野生P53蛋白还可以诱导细胞分化。野生型P53基因失活的细胞经久处于未成熟状态，持续增生。突变型P53则不具备以上的功能。
野生型P53蛋白极不稳定，半衰期很短，而突变型P53则很稳定，可以在核内积聚，这使得可以用免疫组织化学方法检测到它的存在［14］。突变型P53的检测可以很好反映P53基因突变情况［15］。这一点不同于Ras基因。Wee等用S－P法研究了胆囊癌和肝外胆管癌中P53蛋白表达，阳性率分别为73％和64％［16］。他们认为在胆道癌发病过程中，P53基因突变是一个普遍发生的事件，是胆道癌发生内在因素之一。Kamel［10］等的研究结果也表明在胆道癌中普遍存在着P53基因突变。更为重要的是，在两例胆囊上皮不典型增生的标本中，他们也发现了P53蛋白阳性表达。
hanada等研究发现，在病理类型为平坦型的胆囊癌中，P53阳性率高于息肉型胆囊癌。而平坦型癌多为浸润癌［17］。Roa的研究也表明，在早期胆囊癌中，P53的阳性率为23．5％，在进展期胆囊癌中，P53的阳性率达到48．2％。在高分化胆囊癌中，P53的阳性率为25％，而在低分化的胆囊癌中，P53的阳性率达到50％［18］。以上研究均提示P53高表达是肿瘤分化低、处于进展期、预后不佳的标志。
p16是近年发现的比P53更有力地引起正常细胞癌变的肿瘤抑制基因，又称为多肿瘤抑制基因（MTS1）。P16基因定位于人染色体9P21，由三个外显子构成。总长度为8．5Kb。其编码产物P16蛋白是细胞增殖周期的重要调节者和控制者［19］。它是细胞周期依赖性激酶4（CDK4）抑制因子。因而又称M TS1／P16／CDK4。细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的活化，CDK4和D型周期蛋白结合形成复合物能促进细胞从G1→S期的转变，从而促进细胞增生，这可能是恶性肿瘤发生因素之一。P16蛋白能和CDK4结合，抑制细胞转化。近年来有关P16基因纯合性丢失的研究表明，在人类大部分肿瘤中，均有P16纯合性丢失，与杂合性丢失一起，总的突变率为50％。碱基突变和缺失另占25％，故在肿瘤组织中P16总突变率为75％，比P53的50％的突变率高得多。
1995年，Yoshida等人世界上首次报告了P16基因在胆道肿瘤中的突变情况［20］。他们分析了25例胆道肿瘤标本和4个胆系肿瘤细胞株后发现原发胆道肿瘤中P16／MTS1的总突变率为64％（其中胆囊癌80％，胆管癌63％），高于P53突变率。他们认为在胆系肿瘤发生中，P16可能比P53起更重要的作用。但是P16在胆系肿瘤中到底作用如何，具体突变方式如何，因目前研究太少，尚不能得出一个明确结论。
aPC基因和DCC基因是通过对大肠癌研究在人5号染色体上克隆的抑癌基因，前者位于5q21，编码产物分子量超过300，000，调控ras基因表达。后者也位于5q21，在APC附近。关于他们在胆道肿瘤的研究较少。虽然已在2个人类胆管癌细胞株中发现有5号染色体改变［21］，但应用多种基因探针杂交未发现在肝内胆管癌中有5q［21，22］缺失，故认为APC和DCC与胆管癌关系不大［22］。
3 前景和展望
虽然对于胆系肿瘤的分子生物学研究与胃癌、结直肠癌和胰腺癌相比仍不够深入，众多的问题还有待于解决，但是目前的研究结果大大丰富了我们对于胆系肿瘤的认识，这对于寻找早期诊断胆系肿瘤的有效手段具有重要的指导价值。
胆道肿瘤发病率近年明显上升。由于早期诊断困难，故预后极差。寻找一条有效的早期诊断手段是当前研究的重要课题。从胰腺癌的研究中我们可以获得一些启发。1990年Shibata对36例胰腺癌标本作细胞学检查的同时作K－ras基因突变分析，结果25例细胞学检查恶性标本中18例测到了ras基因点突变［23］。3例细胞学检查良性标本无一例发生ras基因突变。8例细胞学检查为不典型增生标本中，有两例发生突变。1991年，Tada等对B超引导下胰腺穿刺所获得的细胞进行基因分析，检测K－ras基因12位点的突变，成功地为2例细胞学检查无法判定病变良恶性的病例作出了诊断［24］。随着研究方法的不断改进，特别是改良的二步PCR－RFLP方法的应用，人们发现胆道肿瘤中也广泛存在着K－ras基因12位点的突变，总突变率在75％～100％之间，接近于胰腺癌突变水平。由于PCR技术灵敏性和特异性极高，可以从几个拷贝的DNA分子中检测到K－ras基因点突变，因而用十二指肠引流或PTCD检查获得胆汁中的脱落细胞，或在B超引导下用细针穿刺胆道肿瘤获得标本，然后用PCR法检测标本中K－ras基因12位点突变，有可能开创一条早期诊断胆道肿瘤的新途径，而且对于常规影像学和细胞学检查有重要补充价值。
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