实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒的比较研究

       作者：刘建军，古丽巴哈尔，阳 帆，陈家敏，何雅青，杨 洪

【摘要】  目的  通过2种检测登革病毒方法的比较，以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法  利用Taqman MGB技术，根据登革病毒3′端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果  RT-PCR检测10份临床血清标本，2份阳性，阳性率为20%。实时荧光PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应，检测10份临床血清标本，5份阳性，阳性率为50％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论  Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。
   
    【关键词】  登革病毒；RT-PCR；Taqman GMB实时PCR
    
    
    【Abstract】  Objective  In order to improve the sensitivity and specificity of detecting dengue viruses， two methods for detecting dengue viruses were compared.Methods  Using Taqman MGB technique， a pair of universal primers and Taqman MGB probe were designed according to a highly reserved sequence of the 3′-noncoding region of dengue viruses type 1-4. Dengue virus strains were used as standard and Japanese encephalitis virus strains were used as control， the real-time PCR assay for specific and sensitive detection of the dengue viruses was established. While 10 serum specimens of ELISA positive were detected by the RT-PCR and fluorescent PCR.Results  There was no cross-reaction with Japanese encephalitis virus. Of 10 specimens， 2 was positive by RT-PCR and 5 was positive by real-time PCR. The test could be completed in 4 hours.Conclusion  The Taqman MGB real-time PCR assay was fast， sensitive and specific. It could be applied to the quick early diagnosis of dengue viruses.
    
   【Abstract】 dengue virus；RT-PCR；Taqman GMB real-time PCR
   
    登革热是流行于热带、亚热带地区的一种急性虫媒传染病，其病原体为登革病毒，近年来随着全球气候变暖和国际的增多，登革病毒感染呈扩大蔓延之势，发病率不断升高。由于缺乏疫苗和有效的防治措施，因此对该疾病实行早期诊断十分必要。
   
    登革病毒属于黄病毒科黄病毒属， 为单股正链ＲＮＡ病毒，基因组长约11ｋｂ。依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型(ＤＥＮ1～4)［1，2］。登革病毒感染的实验室诊断，传统方法是从患者血清中分离病毒，或用血清学方法检测病毒的特异性抗体。但病毒分离费时，检测血清抗体需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清， 同时存在广泛的交叉反应而受到干扰［3］，这些均不利于疾病的早期诊断。近年来国内外均有报道应用RT-PCR检测登革热病毒［4］，但RT-PCR方法容易造成污染，同时也存在从临床血清标本中检测登革病毒敏感性不够的问题。这就需要建立一种更敏感、特异和快速的检测鉴定方法，以实现对登革热患者的早期快速诊断，为预防控制登革热的流行赢得时间。本研究比较了利用TaqmanMGB探针技术的实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒特异性，以期选择特异性好、灵敏度高的检测方法，达到快速诊断登革热的目的。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  毒株及血清标本  登革病毒1～4型标准株由广东省疾病预防控制中心提供，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株由成都生物制品所提供。血清标本采自深圳市近几年发病2周内的疑似登革热病人和发病10天内的疑似乙脑病人，-80℃保存。
   
    1.2  主要试剂  病毒RNA提取试剂盒为Roche公司产品，TaqDNA聚合酶、PCRbuffer、MgCl2、随机引物购自Invitrogen公司，dNTP购自上海生工公司， AMV逆转录酶、RNaseinhibitor购自大连宝生物公司，引物和荧光探针由上海基康生物技术有限公司合成及标记，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
   
    1.3  主要仪器设备  Centrifuge 5415D台式高速离心机购自德国Eppendorf公司， Ultrospec 2000紫外可见光蛋白核酸分析仪购自美国GE公司， 9700基因扩增仪购自美国ABI公司，Gene Genius凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司， Mx4000荧光PCR仪购自美国Stratagene公司。
   
    1.4  引物及探针设计  在GeneBank上检索登革病毒4个血清型中都一致的高度保守序列，根据登革病毒(DEN)聚合蛋白基因的一段高度保守序列，设计登革1～4型RT-PCR通用引物，扩增片段长度为511bp。根据DEN 3端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和Taqman探针，探针5′用FAM报告荧光基团标记，3′用MGB淬灭荧光基团标记，扩增片段长度为68bp。
   
    登革病毒RT-PCR通用引物：
   
    Den-D1： 5′ TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG　3′
   
    Den-D2： 5′ TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC　3′
   
    登革病毒荧光PCR通用引物：
   
    Den-FP： 5′ GCATATTGACGCTGGGAGAGA　3′
   
    Den-RP： 5′GGCGTTCTGTGCCTGGAAT　3′
   
    登革病毒通用探针：
   
    Den-Probe：5′ FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB　3′
   
    引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记。
   
    1.5  病毒RNA提取  1～4型登革病毒标准株用1640培养液溶解，接种C6/36细胞，传代次，按病毒RNA提取试剂盒说明书操作，提取病毒RNA，RNA置-80℃保存备用。
   
    1.6  反转录及普通PCR
    
    1.6.1  RNA逆转录  反应总体积为20μl，在反应管内依次加入：5×缓冲液5μl，2.5mmol/L 4×dNTP 1μl，0.3μg/μl Random（Invitrogen公司生产）引物1μl，提取的RNA 12μl，AMV逆转录酶（10u/μl）1μl混匀。反应条件为：42℃ 60min→95℃加热5min→4℃保存。然后将产物放置于-20℃备用。
   
    1.6.2  PCR扩增  反应总体积为20μl，在反应管内依次加入：10×缓冲液2μl，2.5mmol/L，4×dNTP 1μl，25mmol/LMgCl2 2.5μl，通用引物D1、D2（5μmol/L）各1μl，RT产物0.5μl（Ⅰ型，Ⅱ型，Ⅳ型）、2μl（Ⅲ型，血清标本，阴性对照），Taq酶（5u/μl） 0.25μl，加H2O补足体系。反应条件为：94℃ 5min→94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环40次→72℃延伸10min→4℃保存。
   
    1.6.3  扩增产物电泳分析  配制含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，取10μlPCR产物电泳，在凝胶成像仪上观察并照相记录实验结果。
   
    1.7  实时荧光PCR  反应总体积为25μl，在反应管内依次加入：10×缓冲液2μl，10mmol/L 4×dNTP 0.75μl，50mmol MgCl2/L 2.5μl，引物Den-FP，Den-RP（10μmol/L）各0.5μl，探针Den-probe（5μmol/L）0.6μl，RT产物0.5μl（Ⅰ型，Ⅱ型，Ⅳ型）、2μl（Ⅲ型，血清标本，阴性对照），Taq酶（5u/μl）0.25μl，加H2O补足25μl体系。反应条件是：50℃ 2min→95℃ 10min→95℃ 30s→60℃ 30s，循环40次→4℃保存。采用MX4000实时荧光PCR扩增仪进行扩增，延伸阶段检测荧光。
   
    2  结果
   
    2.1  普通RT-PCR检测结果  1～4型登革病毒标准株、10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG检测为阳性，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株进行RT-PCR检测，在511bp处1～4型登革病毒标准株都出现了目的基因条带，10份疑似登革病毒感染病人血清只有2份出现目的基因条带，其他标本都为阴性，见图1。说明此RT-PCR检测体系具有良好的特异性。
   
    注： DNA分子质量标准；1～4分别为Ⅰ～Ⅳ型登革毒株；
   
    5～13血清标本（其中5和8为同一标本）；

    
    14、15为乙脑病毒对照；-为空白对照 

                图1  登革Ⅰ～Ⅳ型毒株和血清标本PCR扩增结果
   
    2.2  登革病毒Taqman MGB PCR体系检测结果
   
    2.2.1  有效性检验  按1.7方法，分别提取登革病毒1～4标准株RNA，进行反转录的实时PCR，1～4型均观察到荧光信号增强。
   
    2.2.2  特异性分析  登革病毒1～4标准株、乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株经TaqmanMGB体系检测，只有登革病毒1～4标准株观察到荧光信号增加外，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株均没有荧光增加信号，见图2。这证明了此TaqmanMGB检测体系的特异性。
   
    2.2.3  登革病毒TaqmanMGB PCR检测体系的应用  用Ⅱ型登革病毒作为阳性对照，对10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG检测为阳性，8份发病10天内疑似乙脑病毒感染病人血清作为对照，其IgM、 IgG检测为阳性。进行TaqmanMGB PCR检测，结果只有5份疑似登革病毒感染病人血清出现荧光信号增加，其他血清标本均无荧光信号。见图3。注：1、2、3、4分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ登
   
    革病毒标准株 

 
                 图2  登革病毒荧光PCR特异性分析
   
    注：1：Ⅱ型登革病毒标准株；
   
    2～6：疑似登革病毒感染病人血清标本 

               图3  血清标本荧光PCR检测结果
   
    3  讨论
   
    Taqman探针是一条与病原体核酸特异性结合的荧光素标记探针，它的结合位点位于普通PCR的2条引物之间［5］。探针的5′端和3′端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团，PCR扩增在加入一对引物的同时加入荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时， Taq酶发挥它的5′→3′的外切酶功能，将探针切成单核苷酸，5′端发出的荧光信号不再被3′端所吸收而能被仪器检测到。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此，随着PCR产物的不断增加，仪器所检测到的荧光信号越来越强。当标本中不含病原体时，PCR反应不发生，不产生荧光信号，其扩增曲线为一水平线。
   
    TaqmanMGB探针是在Taqman原理基础上提出的［6］。TaqmanMGB探针的突出优点是实验优化、步骤简单，提高了配对与非配对模板间的Tm值差异，由于在探针的3′端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间位置更接近，使杂交的稳定性和重复性大大提高，实验的结果更精确，分辨率更高。
   
    笔者在TaqmanMGB技术基础上，建立了实时PCR检测1～4型登革病毒的方法。上述研究结果表明：（1）本检测方法可靠性好、敏感性高，比普通PCR方法灵敏度提高30%，可检测发病10天内的临床血清标本，而传统的登革病毒分离方法要求发病5天内的标本，才有可能分离出阳性。（2）特异性强，收集荧光在较高的退火温度(60℃)进行，排除了模板的非特异性扩增，同时，与容易造成血清学交叉反应的乙脑病毒及其临床标本都无交叉反应，可用于登革病毒特异性的实时PCR检测。（3）操作简单，结果观察直观明了，采用闭管检测和荧光技术，避免了普通PCR方法容易产生交叉污染而发生非特异性扩增的缺陷，并可防止病毒扩散及环境污染，以及强致癌物溴乙锭对操作人员的危害。（4）快速。传统的登革病毒分离方法耗时较长，至少需半个月，而本方法所需时间仅4h，比传统方法大为缩短，适用于登革病毒的快速准确的检测。

【】

    1  肖维威，马文丽，郑文岭.登革病毒的基因组结构及其基因检测.中华检验医学杂志，2003，26(3)：188-189.    
    2  Jelinek T. Dengue fever in international travelers. Clin Infec Dis，2000，31：144-147.    
    3  Schwartz E， Mileguir F， Grossman Z，et al. Evaluation of ELISA-based sero-diagnosis of dengue fever in travelers. J Clin Virol，2000，19(3)：169-173.    
    4  Drosten C， Gottig S， Schilling S， et al. Rapid detection and quantification of RNA of ebola and marburg viruses， lassa virus， crimean-congo hemorrhagic fever virus， rift valley fever virus， dengue virus， and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol，2002，40(7)： 2323-2330.    
    5  Callahan JD， Wu SJ， Dion-Schultz A， et al. Development and evaluation of serotype-and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus. J Clin Microbiol，2001，39(11)： 4119-4124.    
    6  Zhao JR， Bai YJ， Zhang QH， et al. Detection of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using TaqMan-MGB probe technology. World J Gastroenterol，2005， 11(4)：508-510.