银屑病成纤维细胞培育上清对角质形成细胞增殖的影响

      作者：赵小东，付萌，卢涛，孙林潮，廖文俊，王冬青，刘玉峰

【摘要】  目的  探讨银屑病成纤维细胞对角质形成细胞增殖的作用。方法  原代培养银屑病成纤维细胞、正常人成纤维细胞，无血清培养的角质形成细胞，四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测银屑病成纤维细胞、正常人成纤维细胞培养上清对角质形成细胞增殖的影响。结果  银屑病成纤维细胞培养上清培养的角质形成细胞的增殖活性高于正常人成纤维细胞培养上清组和无血清培养的角质形成细胞。结论  银屑病成纤维细胞可能通过释放某些可溶性细胞因子促进角质形成细胞的增殖，维持银屑病皮损表皮的过度增殖状态。

    【关键词】  银屑病  成纤维细胞  角质形成细胞  增殖

    Effects of cultured supernatant of fibroblast from psoriaticlesions on proliferation activity of keratinocytes

        【Abstract】  Objective  To investigate the effects of fibroblasts in psoriatic lesions on proliferation activity of keratinocyte.Methods  Fibroblasts in psoriatic lesions and normal skin were primarily cultured seperately. Keratinocytes in normal skin were also cultured by Keratinocyte Cell  serum free medium(KC-SFM). The effects of cultured supernatant of fibroblast from psoriatic lesion or normal skin on keratinocytes were determined by MTT colorimetric methods.Results  As opposed to cultured supernatants of normal fibroblasts or KC-SFM， cultured supernatants of fibroblasts from psoriatic lesions increased the proliferative activity of keratinocytes significantly.Conclusion  Fibroblasts in psoriatic lesions can promote the proliferation of keratinocytes and maintain the hyperproliferative state of psoriatic epidermis， which may be mediated by soluble cytokines released by fibroblasts.

    【Key words】  psoriasis  fibroblast  keratinocyte  proliferation

    银屑病是一种以表皮过度增殖为特征的慢性炎症性皮肤病，至今，造成表皮过度增殖的原因尚不十分清楚。本实验通过观察银屑病成纤维细胞培养上清和正常人成纤维细胞培养上清对角质形成细胞影响，探讨成纤维细胞在银屑病发病中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  主要材料和试剂  DMEM培养基、角质形成细胞无血清培养基(KC-SFM)、 Dispase(Gibco，USA)，MTT为(Sigma，USA)。完整的KC-SFM配制：KC-SFM l00ml加入EGF 0.5μg及BPE 5mg。成纤维细胞培养液配制：DMEM 80ml加入胎牛血清 20ml。银屑病患者活检标本，健康成人包皮均来自西京门诊。

    1.2  成纤维细胞培养  取病理确诊的银屑病患者活检标本，0.25％洗必泰液消毒10min，无菌生理盐水漂洗3次，剪去皮下组织，0.25％Dispase消化4℃，16h。分离表皮，将真皮剪碎，0.25％胰蛋白酶室温消化15min，终止消化，沉降，收集上层细胞悬液后，重复消化收集。细胞悬液1200r／min离心洗涤2次，含10％胎牛血清DMEM重悬，调整细胞浓度为105／ml，接种于96孔培养板。37℃，5％CO2：孵育，隔日换液，至70％融合，收集换液后48h后的培养上清备用。取手术切除的健康成人包皮，以相同方法培养正常人成纤维细胞，收集培养上清。

    1.3  角质形成细胞培养  取手术切除的健康儿童包皮，0.25％洗必泰液消毒10min，无菌生理盐水漂洗3次，剪去皮下组织，并剪成5mm×10mm［2］皮块，0.25％Dispase消化 4℃，16h。分离表皮，表皮用0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶 (1：1)室温消化10min，吸管吹打表皮，尼龙网过滤收集基底细胞，含10％胎牛血清DMEM，1000r／min离心洗涤2次，每次10min。用KC-SFM调整细胞浓度为105／ml，接种于96孔培养板。37℃，5％CO2孵育，隔日换液，至70％融合。每孔分别加入 100μl银屑病和正常人成纤维细胞培养上清，再加入100μl完整的KC-SFM，孵育72h，每组设3个复孔。

    1.4  MTT法检测细胞代谢活性  MTT法观察银屑病成纤维细胞、正常人成纤维细胞的生长曲线，每组设3个复孔；于培养的24h、48h、72h用MTT法检测正常人成纤维细胞培养上清和银屑病成纤维细胞培养上清处理的角质形成细胞的代谢活性(KC-SFM为阴性对照)；每孔分别加入20μl  MTT溶液(浓度为5g／L，用PBS稀释)，孵育4h后吸除，二甲基亚砜显色10min，用酶联免疫检测仪以490nm检测A值。

    1.5  统计学方法  采用SPSS10.0统计软件对数据进行配对t验。  

    2  结果

    2.1  成纤维细胞生长曲线  见图1，MTT法观察培养的银屑病成纤维细胞和正常人成纤维细胞的生长速度，每天测定的A490nm值，共7d，经配对t检验比较差异无显著性(P＞0.05)。

    图1  银屑病成纤维细胞和正常人成纤维细胞生长曲线

    2.2  成纤维细胞培养上清对角质形成细胞代谢活性的影响  用MTT法检测角质形成细胞代谢活性，采用SPSS10.0统计软件对数据进行配对t检验后发现，银屑病成纤维细胞培养上清处理的角质形成细胞的代谢活性明显高于正常人成纤维细胞培养上清处理的角质形成细胞和KC-SFM培养的角质形成细胞(P值均小于0.05)，正常人成纤维细胞培养上清处理的角质形成细胞和KC-SFM培养的的角质形成细胞代谢活性差异无显著性(P>0.05)。(见表2)

    表2  成纤维细胞培养上清对角质形成细胞代谢活性A490nm的影响  (x±s，n=3)

                    注：与对照组比较，*P＜0.05

    3  讨论

    银屑病是一种以表皮过度增殖为特征的慢性炎症性皮肤病，成纤维细胞对银屑病角质形成细胞异常增殖的影响日益受到人们的重视。Saiag P用皮肤类似物模型发现银屑病成纤维细胞可维持银屑病皮损表皮的高增殖状态，而正常人成纤维细胞则不能维持银屑病皮损表皮的高增殖状态，因此，推测银屑病的原发缺陷可能在真皮［1］。本实验发现银屑病成纤维细胞培养上清能明显促进角质形成细胞的增殖，说明银屑病成纤维细胞对角质形成细胞增殖的作用并不依赖细胞间的相互接触。

    有研究发现银屑病成纤维细胞能产生较高水平的IL-6［2］、IL-8［3］、角质形成细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)［4］、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)［5］、内皮细胞刺激血管生长因子 (endothelial cell stimulating angiogenesis factor，ESAF)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)［6］。笔者在实验中发现银屑病成纤维细胞和正常人成纤维细胞的增殖活性上没有差异，其生长曲线基本一致。因此，笔者认为银屑病成纤维细胞在增殖活性并不存在异常，其异常主要在于表达某些细胞因子的差异，银屑病成纤维细胞通过旁分泌释放高水平的细胞因子可能是造成角质形成细胞过度增殖的重要始动因素。

    【】

    1  Saiag P，Coulomb B，Lebreton C，et al.Psoriatic fibroblasts induce hyperproliferation of normal keratinocytes in a skin equivalent model in vitro.Science，1985，230(4726):669-672.
    2  Debets R，Hegmans JP，Buurman WA，et al.Expression of cytokines and their receptors by psoriatic fibroblasts Ⅱ decreased TNF receptor expression.Cytokine，1996，8(1):80-88.
    3  KonstantinovaNV，Duong DM，Remenyik E，et al.Interleukin-8 is induced in skin equivalents and is highest in those derived from psoriatic fibroblasts. J Invest Dermatol，1996，107(4):615-621.
    4  Finch PW，Murphy F，Cardinale I，et al.Altered expression of keratinocyte growth factor and its receptor in psoriasis.Am J Pathol，1997，151(6):1619-1628.
    5  Espinoza LR，Espinoza CG，Cuellar ML，et al.Fibroblast function in psoriatic arthritis Ⅱ Increased expression of beta platelet derived growth factor receptors and  increased  production of growth factor and cytokines.J Rheumatol，1994，21(8):1507-1511.
    6  Bhushan M，McLaughlin B，Weiss JB， et al.Levels of endothelial cell stimulating angiogenesis factor and vascular endothelial growth factor are elevated in psoriasis. Br J Dermatol，1999，141(6):1054-1060.