多菌型麻风联合化疗期满后麻风菌的活性及复发的研究*

     作者：黄进梅，郑和平，潘慧清，曾维英，吴兴中，李美玲

【摘要】  目的  探讨多菌型麻风联合化疗(MDT)后麻风菌的活性及复发的关系。方法  用荧光素乙酰乙酸盐(FDA)和溴乙啡啶(EB)双荧光染色法检测麻风菌的活性，抗酸染色  (AFB)记录细菌指数(BI)及形态指数(MI)。结果  检测多菌型麻风患者共29例，其中初治MDT期满22例，复发MDT期满7例，共检出绿染菌4例。抗酸染色查菌阳性者中复发患者平均BI高于初治患者平均BI，两者间差异有非常显著性(P<0.01)。复发未治患者5例，AFB、 FDA／EB染色均阳性，平均绿染菌49.6％。结论  MDT期满后FDA／EB染色查到绿染菌或者抗酸染色BI较高者，应适当延长MDT时间或用其它替代疗法治疗直至查菌阴转，以防复发。

    【关键词】  联合化疗  麻风菌  活性  复发

    Study on viability of mycobacterium leprae after multidrug therapy in multibacillary leprosy and relapse

    【Abstract】  Objective  To investigate viability of M. leprae after multidrug therapy(MDT) in multibacillary leprosy and relapse.Methods  Viability of M.leprae was defected with fluorescent staining procedure(FDA／EB)and AFB for bacteria index(BI)and modality index.Results  A total of 29 cases multibacillary leprosy patients，including 22 cases after MDT， 7 cases relapse after MDT，and 4 of them were green-stained bacilli.The BI of relapse patients with MDT 2 years was significantly higher than that BI first patients with MDT 2 years(P<0.01) in positive skin smears.The average percentage of the green-stained bacilli was 49.6％in 5 cases relapse patients before MDT.Conclusion  If the patients still have green-stained bacilli by FDA／EB and the BI is higher in positive skin smears，the MDT ought to be continued till negative skin smears.

     【Key words】 multidrug therapy  mycobacterium leprae  viability  relapse

    麻风病存在复发是一个公认的问题，不管是以前的单疗还是现在使用的联合化疗，复发都不可避免。因此早期发现、及早治疗对防止患者畸残及传播显得尤为重要。由于在复发患者中，多菌型麻风(MB)比少菌型麻风(PB)复发的危险性高得多［1］，因此预防多型麻风的复发更值得关注。用荧光素乙酰乙酸盐(FDA)和溴乙啡啶(EB)双色荧光染色法检测麻风菌的活性在国内外早有报道，笔者试图采用FDA／EB荧光染色检测MB及复发患者联合化疗(MDT)期满后麻风菌的死活，探讨麻风菌活性与复发的关系。

    1  材料与方法

    1.1  标本及来源  初治MDT期满后MB患者22例，复发MDT期满后MB患者7例，复发未治疗MB患者5例。病例来自麻风院、村及家庭治疗者。患者按常规方法皮肤刮片取材，每例患者制作2张涂片。1张火焰固定后做抗酸染色(AFB)，记录细菌指数(BI)及形态指数(MI)。1张干燥后即用冰瓶保存转送实验室(少于8h)即做，或置-70℃保存，在1周内做FDA/EB荧光染色。

    1.2  试剂  荧光素乙酰乙酸盐(Fluorescein diacetate FDA)和溴乙啡啶(Ethidium bromde EB)均为Sigma公司产品，FDA用丙酮溶解配成浓度为500μg／ml的保存液，EB用0.01M pH7.2 PBS溶解配成浓度2000μg／ml保存液，置-20℃保存。工作液用0.01M pH7.2 PBS分别加入FDA、EB保存液配制，最终浓度FDA为2μg／ml，EB为4μg／ml。

    1.3  方法  将新鲜配制的工作液滴于恢复至室温的涂片上，置37℃水浴30min，弃去染液，用 0.01M pH7.2 PBS轻洗3次，每次5min，待其自然干燥后，用缓冲甘油封片，立即用荧光显微镜(B系统)镜检。活菌呈绿色，死菌呈桔红色，用油镜绿菌百分比。

    2  结果

    初治MDT期满MB患者22例，其中瘤型(LL)11例，界线类偏瘤型(BL)8例，中间界线类(BB)3例。AFB和FDA／EB染色均阳性12例，查菌阳性率54.5％，查菌阳性者平均BI为0.95。在查菌阳性的12例患者中，有3例可见绿染菌，绿菌率分别为2％、3％和5％。复发MDT期满MB患者7例(单疗5例，联合化疗2例)，其中瘤型(LL)5例，界线类偏瘤型(BL)2例。AFB和FDA／EB染色均阳性4例，查菌阳性率57.1％，查菌阳性者平均BI为1.44。在查菌阳性的4例患者中，有1例可见绿染菌，绿菌率为3％。结果见表1。

    表1  29例MB患者MDT期满后AFB、FDA／EB检查结果

    复发未MB患者5例(单疗2例，联合化疗3例)，抗酸(AFB)及荧光(FDA／ EB)染色均阳性，平均绿染菌为49.6％，与Odinsen［2］等报道未治疗者平均绿染菌52%～68％相近。

    3  讨论

    本研究发现不管是初治还是复发MB患者MDT期满后查菌阳性率均较高，分别为54.5％、 57.1％，两者差异无显著性。但是在查菌阳性者中，复发患者平均BI(1.44)明显高于初治患者平均BI(0.95)，两者间差异有非常显著性(P<0.01)，这可能与复发者麻风菌对药物的敏感性降低，细菌消退较慢有关。在初治MDT期满22例MB患者中，有3例检出绿染菌，平均绿染菌3.33％，与孟梅白等［３］报道相符；复发MDT期满7例中有1例检出绿染菌，绿染率为3％。在初治MDT期满时查菌，有1例患者BI为2.83尚有皮损出现，另1例患者BI为2.33出现麻风反应。所有这些均提示对MB患者经MDT治疗2年后全部停药是值得讨论的，特别是MDT期满BI较高患者。另外，5例复发未治患者皮肤查菌时并非全部为完整菌，有2例绝大多数为链状、短杆状断裂菌，绿菌率约为30％，证明了活菌不一定都是完整菌，非完整菌同样具有活性。

    WHO认为在完成MDT治疗后发生复发的危险性较小，但经过多年实践，有学者提出不同意见，认为WHO推荐的方案是基于BI偏低者［4］，对于MDT期满BI较高者应有足够的警惕性。本次研究的5例初治MDT复发未治患者均为MB，复发时间分别为38个月、63个月、134个月、56个月和159个月，平均107.6个月，治愈—复发间隔不一，最长159个月比Pai［5］报道的128个月还长，由此可见MDT后复发时间具有不确定性，MDT复发也将持续多年。

    联合化疗普及于20世纪80年代中期，MDT实施已将近20年，考虑到MDT后晚期复发的危险性，目前复发患者已陆续出现，对可疑复发患者应及早检查，及时治疗。基于本次研究结果，建议MDT治疗后FDA／EB荧光染色有绿染菌及皮肤查菌BI较高患者，应注意随访，适当延长MDT治疗时间或采用替代疗法治疗至细菌阴转。

    【】

    1  吴勤学，张良芬，陈小红，等.用ND-ELISA检测已治愈的麻风患者血中IgM抗体水平.中华皮肤科杂志，2004，37：357-359.
    2  Odinsen O，Nilson T，Humber DP，et al.Viability of mycobacterium leprae:a comparison of morphological index and fluorescent staining techniques in slit-skin smears and μ.Leprae suspensions.Int J Lepr，1986，54(3)：403-408.
    3  孟梅白，黄进梅，熊斌，等.以荧光染色(FDA／EB)检测多菌型麻风用联合化疗时麻风菌的死活.麻风杂志，1989，5：129-131.
    4  沈建平，李文忠，陈祥生，等.中国12403例麻风复发病例分析.中华皮肤科杂志，2000，33(增刊)：10-13.
    5  Rajan MA.Relapse after MDT in MB cases.Indin J Lepr，1995，67：103-105.