微血管发生的扫描电镜观察

【摘要】  目的  探讨胎生大鼠晶体后缘血管膜微血管生成及形成的各种方式，寻求研究血管生成及形成调节因素的最佳方法。方法  使用胎生19日及生后3日、6日的Albino 大鼠各20只，取出晶体，用H-500扫描电镜观察。结果  大鼠晶体血管膜血管发生方式：（1）单向芽生方式；（2）双向芽生方式；（3）胶原及周皮细胞介导的芽生方式；（4）血管母细胞诱导的芽生方式；（5）芽生芽的方式。结论  大鼠晶体血管膜是一极好的研究血管发生的实验材料。
   
    【关键词】  微血管生成  微血管形成  芽生  血管母细胞
    
      
    【Abstract】  Objective  To explore the ways of microangiogenesis and capillary formation that lie in tunica vasculosa of crystal posterior border of viviparital rat. We also tried to find the best method for study factors of control microangiogenesis and capillary formation.Methods  We used viviparital nineteen-day’s Albino rat and three days and six days after birth， twenty of each sorts. We observed the crystals under H-500 scanning electron microscope.Results  The producing ways of tunica vasculosa microangiogenesis of rat’s crystal：(1)single-directional germination；(2)bi-directional germination；(3)collagen and pericyte mediated germination；(4)angioblast inducted germination；(5)germ germinated.Conclusion  The tunica vasculosa of rat’s crystal is a good material to study angiogenesis.
   
    【Key words】  microangiogenesis  capillary formation  germination  angioblast
   
    血管发生在许多生物过程中起着非常重要的作用，如生物体的生长发育、创伤愈合、肿瘤发生、浸润与转移等。
   
    血管生成与血管形成是两个不同概念。血管生成是指活体组织内原先存在的血管以内皮细胞芽生方式生成新生血管。血管形成是胚胎时期有内皮细胞前体，也称内皮祖细胞或血管母细胞逐渐增生为条索状，最后形成血管。肿瘤内血管形成两种方式都存在。
   
    肿瘤瘤体内有血管存在后，不仅是肿瘤生长突然加速，也开始了浸润和转移的生物学行为。因此抑制肿瘤血管形成已经成为恶性肿瘤新途径。研究肿瘤血管生成及形成过程，始终苦于没有连续观察的目的物。经典的方法是用鸡胚卵黄囊膜的血管进行研究，哺乳动物还没有发现有理想的可供连续观察的研究方法。
   
    胎生时期，哺乳动物由颈内动脉向眶内玻璃体发出分支，形成玻璃体动脉，抵达晶体后缘，开始了血管生成及血管形成，并形成血管膜来营养晶体［1］。从胎生的不同时期的晶体血管膜可以观察到血管形成的全过程，为肿瘤抑制血管形成研究提供最佳的研究途径。本研究利用描述电镜观察，旨在揭示血管生成及形成的全过程及形态学的不同特点。
   
    1  材料和方法
   
    使用胎生19日及生后3日、6日的Albino 大鼠各20只，戊巴比妥腹腔注射麻醉，以PBS水经左心洗净心血管内的血液，当右心耳切口处流出清亮液体时，在灌注3%磷酸缓冲的戊二醛溶液，体视显微镜下取出眼球，稍经戊二醛固定后，用眼科剪仔细剖开并去除球后壁，注意勿伤及晶体后缘。然后投入6N盐酸并振荡加温水解片刻，充水水洗，利用叔丁醇冰冻干燥法干燥，白金镀膜，扫描电镜观察。
   
    2  结果
   
    本研究从晶体血管膜上观察到了以下5种形态各异的生长方式：(1)单向芽生方式：是由原位的毛细血管内皮细胞增生，突破基板形成芽状。有的血管芽顶端形成依附于晶体的翼状基质，有的血管芽顶端有放射状排列的胶原并固定于晶体。(2)双向芽生方式：相邻的两血管相向生芽，在对接处可有玻璃体细胞及其衍生的周皮细胞牵拉覆盖。(3)胶原及周皮细胞介导的芽生方式：相邻的两血管间先有粗大的胶原牵拉，周皮细胞再拉长胞体沿此胶原束向对侧攀缘移动，形成间桥，内皮细胞再在周皮细胞牵引下向对侧增生成芽。有时血管靠的太近，可直接由周皮细胞搭桥，对侧血管壁向下凹陷形成窝，以利于周皮细胞抵达后嵌入，形成稳固的周皮细胞性间桥，便于芽生。(4)血管母细胞参与的芽生方式：血管网间常见有多突的，星状的血管母细胞，它们伸出2个或2个以上的细胞长突搭在邻近和血管壁上。长突抵达处，立即有周皮细胞覆盖于抵达点，有时甚至可见该种细胞伸出超出本胞体十数倍的长突抵达远处的血管。胞体及其长突上亦有周皮细胞附着，新生血管继而沿其长突和胞体形成。(5)芽生芽的方式：在众多血管源性细胞长突伸进原过程中，从其侧面又形成新芽伸向邻近的血管。有趣的是，先形成的芽尚未抵达彼端，周皮细胞已在彼端等待覆盖联接的空隙。上述种种方式交互存在。见图1～4。
    
                
   
    图1  10μm×1600单向芽生方式，顶端有翼状基质，新形成血管接头处有周皮样细胞及玻璃体细胞覆盖
    
                
   
      图2  10μm×1650对向芽生方式，并对接，并以周皮样细胞，牵拉覆盖
    
                
    
       图3  10μm×2000胶原及周皮样细胞介导的芽生方式
    
               
   
        图4  10μm×1600血管母细胞参与的芽生方式    
    
    3  讨论
   
    胎生时期颈内动脉所发出的血管分支有一支进入眶内形成玻璃体动脉，玻璃体动脉反复分支后抵达晶体后缘，形成有密集血管网的晶体血管膜［2］。玻璃体内没有静脉，血液通过玻璃体边缘晶体外血管系回心。血管膜在胚胎期营养晶体并使之不断长大，血管膜在个体出生前后萎缩蜕化消失。胎生不同时期可观察到血管从生成、形成到蜕化的不同形态，是研究血管新生的最佳样板。
   
    血管生长的芽生方式是人们的通常认识，但各种芽生方式不同表现报道不多。本文观察到的不同芽生方式，体现了生物组织血管发育的演进过程。此外芽生形成的血管网，在早期（3日），尚可见到血管母细胞也参予血管形成，二者同时进行，以往还甚少报道。
   
    在上述的各种芽生方式中，血管周皮细胞积极参与其中。其中，两相向芽生的新生血管即将对接时，周皮细胞要么牵拉两芽顶，要么复盖裂隙处，起修补作用。其二，在芽生血管即将抵达另一血管外壁时，周皮细胞介于两者之间起牵拉及导向作用。其三，周皮细胞可合成并分泌细胞间粘拉物质，即可补充新生血管内皮细胞间质，又可固定两相向新生血管的芽顶。本研究观察到周皮细胞近处有薄层翼状物及排泄小泡可以佐证。周皮细胞的来源可有多种可能。Nakayasu采用H3-胸腺嘧啶标记法，研究角膜血管新生过程，发现周皮细胞也结合了H3-胸腺嘧啶，并分泌多种基底膜物质，认为周皮细胞参与血管形成［3］。本研究见到周皮细胞可能来自玻璃体细胞，也可能来自血管母细胞，而后者是否来自局部的干细胞尚待研究。血管生成及形成与局部细胞外基质，炎性细胞以及许多肽生长因子的分泌有关。本文见到芽生血管顶端有放射状排列的胶质以及局部形成的薄层翼片状物，可能是血管生成的先驱物质，对血管生成有导向作用。Mcauslan等提出基质中纤维黏膜蛋白（FN）有促内皮细胞增殖的作用［4］。特别是Ⅳ型胶元能介导含层黏膜蛋白（LN）培养基里内皮细胞的增生。本文以三维结构的方式看到此种现象。此外，在血管生芽的前期有周皮样细胞生成，似乎证明周皮细胞也有强烈诱导血管生成的作用。此外，本研究在血管膜中看到了血管母细胞参与血管形成，两种方式同在，似乎未见报道。
   
    肿瘤内血管形成后，肿瘤生长加速并开始浸润和转移。近年的研究发现，肿瘤生长最活跃的边缘区，其血管形成也最密集［5］。众多研究也发现了血管生成及形成的始动因子是血管生成因子，如VEGF及其受体家族、FGF家族及其受体、Ang和Tie受体家族等［6］。肿瘤浸润与转移又与基质金属蛋白酶（MMPs）表达过多有关，而组织型金属蛋白酶抑制物（TIMPs）对其又有抑制作用。众多的研究都在肿瘤晚期的组织中进行观察不可能有连续动态的表述，本研究提供了血管形成机制，以及抑制血管形成研究的有效目的物，对调节肿瘤血管形成的研究将十分有意义。
   
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    1  Boeve MH.Early morphogenesis of the canine lents，hyaloid system，and vitreous body.Anatomical Record，1988，220-435.    
    2  Wang Jialun.The tunica vasculosa lents： an expeolient system for studying vascular formation and regression.Electron Microsc，1990，39-46.    
    3  张伟.角膜新生血管形成研究新进展.国外医学·眼分册，1991，14-232.    
    4  Mchuslan BR.Uariant endothelial cells.Fibronection as a transducer of signals for migration and neovascularisation.Cell physil，1980，104-178.    
    5  Yancopoulos GD.Vascular-specific growth factors and blood vessel formation.Nature，2000，407(6801)：242-248.    
    6  von Marschall Z，et al.Dual mechanism of vascular endothelial growth factor upregulation by  hypoxia in human hepatocellular carcinoma.Gut，2001，48(1)：87-96.