锰对人脐静脉内皮细胞及半胱天冬酶表达影响

【关键词】  锰;人脐静脉内皮细胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)

　　摘要： 目的   探讨锰对人脐静脉内皮细胞系HUVEC-304细胞生长周期及半胱天冬酶3(caspas3)、半胱天冬酶8(caspase8)表达的影响。方法   以100～800μmoml/L)的氯化锰分别处理HUVEC-304细胞24～72h后，四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测EVC-304细胞的生长活性；流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡情况；蛋白印迹法（Western blot）检测HUVEC-304细胞在，氯化锰半数抑制浓度(IC50)400μmol/L作用24h时caspase8、caspase3的表达。结果   氯化锰可呈时间及剂量依赖性抑制HUVEC-304细胞的增殖和诱导细胞凋亡,抑制率为2234%～9094%，凋亡率为1020%～9873%。氯化锰24hIC50约为400μmol/L，在此浓度下，HUVEC-304细胞caspase8、caspase3表达显著增高,(P<005)。结论   氯化锰能够抑制HUVEC-304细胞的增殖，呈明显的时效和量效关系。caspase8、caspase3表达增高在细胞增殖和凋亡中起重要的作用，可能是其作用机制之一。

　　关键词： 锰;人脐静脉内皮细胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)

　　Effect of manganese on growth of HUVEC-304 cells and expression of caspase  

　　Abstract： Objective   To investigate the effect of manganese on growth of HUVEC-304 cells and the expression of caspase8、caspase3.Methods   HUVEC304 cells were given with various concentrations of MnCl2.The inhibitory ratio was measured by MTT assay.Apoptosis was observed by flow cytometry(FCM).The expression of caspase3 and caspase8 was measured by Western blot.Results   MTT results revealed that manganese chloride (from 100 to 800μmol/L) might suppress the proliferation of HUVEC-304 cells(inhibitory ratio were 22.34%～90.94%) and induce apoptosis (apoptosis ratio were 10.20%～98.73%) in dose and time-dependent manner.The result of Western Blot showed that manganese inhibited caspase3 and caspase8 expression (P<0.05).Conclusion   Manganese can inhibit proliferation of HUVEC-304 cells with time-and dose-dependent manner.These may be one of important mechanisms that manganese suppressed the proliferation of HUVEC-304 cells and induced apoptosis.

　　Key words： manganese;HUVEC-304 cells;apoptosis ;caspase3;caspase8
     
　　锰可以通过诱导细胞产生不配对的自由基形成大量的过氧化物及影响细胞能量代谢等途径诱导细胞凋亡而发挥毒性作用〔1,2〕,但对细胞凋亡相关基因半胱天冬酶8(caspase8)、半胱天冬酶3(caspase3)及蛋白产物的影响研究较少。本研究通过体外试验，观察锰对人脐静脉内皮细胞系HUVEC-304细胞生长及caspase8、caspase3表达的影响，探讨锰诱导细胞凋亡分子机制。

　　1   材料与方法

　　11   主要试剂及抗体   氯化锰(天津博迪化工有限公司)，分子量1977,纯度>99%,溶解于二甲基亚砜（DMSO），分装备用。RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清025%的胰酶(中山凌飞公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司)。caspase3、caspase8一抗为鼠抗人，二抗为羊抗鼠(美国晶美生物工程有限公司)。

　　12   方法  

　　121   细胞和细胞培养   HUVEC-304细胞株(武汉大学细胞保藏中心)。在含有10%的胎牛血清、青霉素100u/ml及链霉素100mg/ml的RPMI-1640培养基中37℃、5%CO2条件下传代培养。取对数生长期、生长良好、细胞活性大于98%的细胞进行实验。

　　122   细胞生长活性检测   采用MTT比色法，取对数生长期的HUVEC～304细胞进行实验，将不同浓度的氯化锰100～800μmol/L加入10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640的培养基中，调细胞浓度为5×105/ml，接种于96孔，每种剂量浓度为一组，每个浓度3个平行孔，置37℃、5%CO2培养箱培养不同时间（24，48，72h）后，每孔加20μlMTT，培养4h，弃MTT，每孔加DMSO 150μl，充分溶解。选择490nm波长，酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值。HUVEC-304细胞的生长抑制率=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。

　　123   流式细胞仪检测细胞凋亡   用荧光素标记的膜联蛋白V(Annexin-V-FITC)及碘化丙啶（PI）双标流式细胞仪检测细胞凋亡，分为不同浓度实验组及对照组。分别加入终浓度为100～800μmol/L的氯化猛作用24h，用70%乙醇4℃固定2h，磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液洗3次，离心去上清。用结合缓冲液37℃孵育60min，195μl细胞悬液加5μl Annexin-V-FITC，混匀，室温10min。用缓冲液洗涤细胞1次，在190μl结合缓冲液中重悬，然后再加10μl20μg/mlPI，流式细胞仪检测。

　　124   细胞蛋白质样品制备及蛋白定量   经处理后的细胞立即弃去培养液,洗涤,离心,加预冷的细胞裂解液(01mol/LNaCl,001mol/LTrisHCl,pH76,0001mol/L乙二胺四醋酸（EDTA）,100μg/ml蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF),2μg/mL，亮肽素(Leupeptin) 01ml,裂解30min,然后于10000g离心10min,取上清备用。以上所有操作均在4℃下进行。测定蛋白,并调各组蛋白浓度一致。

　　125   蛋白印迹法(WesternBlot)   Western Blot方法检测caspase3、caspase8,X线曝光显影,软件进行扫描定量,每个浓度组重复3次,取均值代表测定结果。

　　13   统计分析   应用SPSS110统计软件进行t检验、单因素方差分析(ANOVA)。

　　2   结果

　　21   锰对HUVEC-304细胞增殖的影响   锰对HUVEC-304细胞生长呈时间剂量依赖性,锰染毒培养24，48，78h后，HUVEC-304细胞生长抑制率分别为100μmol/L(2234±822)%，(2747±851)%，(3807±986)%；200μmol/L(3362±969)%，(4256±095)%，(5935±236)%；400μmol/L(5503±620)%，(6212±195)%，(6960±377)%；800μmol/L(7606±151)%，(8129±154)%，(9094±128)%，各组比较差异有统计学意义(P<001),24hIC50为400μmol/L。

　　22   锰诱导HUVEC-304细胞凋亡情况(表1)   锰对HUVEC-304细胞凋亡具有诱导作用,浓度为100μmol/L MnCl2培养HUVEC-304细胞24h,即可引起细胞明显凋亡,并随氯化锰剂量的增加呈剂量-反应关系。

　　表1   不同浓度氯化锰诱导HUVEC-304细胞的凋亡率（略）

　　注：与对照比较，* P＜001；n=3

　　23   锰对HUVEC-304细胞caspase3、caspase8表达的影响   Western blot蛋白印迹法检测结果显示,浓度为400μmol/L氯化锰染毒培养HUVEC-30细胞24h后，caspase8和caspase3表达均明显升高,A值分别为(48803±216)，(47631±205),与对照组比较(9013±161)，差异有统计学意义(P<001)。

　　3   讨论

　　caspase活性的变化是细胞凋亡的重要调节机制。研究表明caspase是一切凋亡信号传导的共同通路〔3，4〕。其中caspase8是死亡受体途径中最重要的启始因子之一,该酶启动后可以直接激活效应caspase的级联反应,诱导caspase3、caspase6的活化,还可以作用于Bid(Bcl-2家族促凋亡成员),被剪切后的Bid转位至线粒体内,诱导线粒体膜电位的丧失和细胞色素C的释放,后者与凋亡蛋白酶激活因子-1Apaf-1(apoptosis associated factor-1)和caspase9形成凋亡小体,启动下游caspase效应酶的激活,最终诱导细胞凋亡〔5〕。有研究表明，锰可通过改变相关基因的调控及表达诱导细胞凋亡〔6〕。本实验结果显示，氯化锰对人脐静脉内皮细胞增殖具有明显的抑制作用,并能诱导调亡呈明显的量效和时效的关系。当氯化锰染毒浓度为400μmol/L时，HUVEC-304细胞培养24h,其caspase8、caspase3的蛋白水平明显升高,说明氯化锰可通过上调细胞caspase8、caspase3基因的表达来诱导其凋亡诱导。由于细胞凋亡受多基因的调节,因此氯化锰诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的机制尚需深入的研究。

　　〔1〕   Malecki EA.Manganese toxicity is association in ras primary striatal neurons［J］.Brain Res Bull,2001,55(2):225-228.

　　〔2〕   王悦,段春礼,张海燕,等.锰对多巴胺能神经元毒性的研究［J］.神经解剖学杂志,2001,17(1):57-61.

　　〔3〕   Fujiura S,Suzumiya J,Yamada Y.Downregulation of Bcl-xl and activation of caspase during retinoic acid-induced apoptosis in an adult T-cell line［J］.Hematol,2003,4(5):328-335.

　　〔4〕   Maclachlan TK,Ei-deiry WS.Apoptotic threshold is lowered by p53 transactivation of caspase-6［J］.PANS,2002,99(14):9492-9497.

　　〔5〕   Cowling V,Downward J.Caspase-6 is the direct activator of caspase8 in the cytochrome c-induced apoptosis pathway:absolute requirement for removal of caspase6 prodomain［J］.Cell Death Differ，2002,9(10):1046-1050.

　　〔6〕   Chen JK,Tsao GC,Zhao QQ,et al.Differential cytotoxicity of Mn (Ⅲ) and Mn (Ⅱ):Special reference to mitochondrial［Fe-S］containing enzymes［J］.Toxicol Applied Aharmacol,2001,17(5):160-168.