铅硒联合作用对原代培养海马神经元影响
【关键词】 铅；硒；海马；神经元；神经突起
摘要： 目的 观察铅、硒对原代培养的海马神经元生长及存活的影响，研究硒对铅的神经细胞生长抑制的拮抗作用。方法 建立新生Wistar大鼠海马神经元原代无血清培养技术，通过PbCl2,Na2SeO3单独及联合作用，观察神经细胞的生长和存活情况。结果 10-5mol/L铅明显抑制了原代培养的海马神经元突起生长，引起神经元存活率下降；单独硒(2×10-6mol/L)有明显促进海马神经元突起生长的作用，尤其在神经元突起生长早期；但对海马神经元存活率的影响不明显。铅和硒共同孵育时，培养早期硒能拮抗铅对神经元突起延伸的抑制，但随着培养时间延长，这种拮抗作用消失；从神经元存活率来看，在实验剂量下，未见硒能拮抗铅对神经元存活的抑制作用。结论 铅具有抑制神经元生长和存活的毒性，本实验剂量下的硒在细胞培养早期有促进神经元突起生长和拮抗铅对神经元生长和存活的抑制作用。
关键词： 铅；硒；海马；神经元；神经突起
Effect of lead and selenium on primary cultured hippocampal neurons.
Abstract： Objective To study the effect of lead and selenium on the growth and survival of primary cultured hippocampal neurons.Methods The primary culture of hippocampal neurons of newborn Wistar rats with serumfree medium was established.After cocultured with PbCl2 and Na2SeO3 respectively and simultaneously,the growth of neurites and survival of neurons were tested.Results Pb2+(10-5mol/L)delayed the growth of neurons,shortened the length of neurites,and decreased the neurons' survival rate.Selenium(2×10-6mol/L) stimulated the growth of neurites,especially at early time of culture.There was no significant effect of selenium at studied dosage on survival rate of hippocampal neurons.The results of cocultivated with PbCl2 and along with the culture time prolongation,the antagonistic effect of selenium declined.The antagonistic effect of selenium on the inhibition of neurons' survival rate caused by lead wasn't observed.Conclusion Lead inhibited the growth and survival of hippocampal neurons.At studied dosage selenium accelerated the growth of hippocampal neurons and antagonized the lead toxicity at the early culture time.
Key words： lead;selenium;hippocampus;neuron;neurite
铅具有显著的神经发育毒性。毒实验和人群流行病学调查表明，铅能对神经系统造成不可逆性损害，严重损坏海马神经元，影响学习、记忆及行为发育〔1，2〕。硒有防止铅吸收和加速其排泄的作用，因此，硒有可能成为有效防治铅神经毒性的重要资源〔3〕。为了解硒拮抗铅神经毒性的效果和研究其拮抗作用机制，同时也为更多有效地利用硒，本试验对体外原代培养的Wistar乳鼠海马神经元进行低剂量PbCl2和Na2SeO3染毒，观察低水平铅、硒单独和联合作用对神经细胞生长和存活的影响。
1 材料与方法
11 材料
111 试剂 解剖液、种植培养液、无血清培养液［由98%Neurobasal培养基和2%B27(美国Gibco公司)无血清培养基添加剂和1%的青霉素、链霉素和005mol/L的谷氨酰胺(美国Sigma公司)组成］；胰酶、DNase Ⅰ、左旋多聚赖氨酸和台盼兰(美国Sigma公司)；PbCl2(上海试四赫维化工有限公司)；Na2SeO3(天津化学试剂研究所)。神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体和神经丝蛋白(NF)抗体(北京中山生物技术有限公司)。
112 仪器 CO2细胞培养箱(美国Shel Lab公司)；全自动图像分析系统(德国KONTRON公司)；图像摄录输入仪(日本JVC公司)；倒置显微镜(德国ZEISS公司)。
113 动物 出生24h内Wistar大鼠(中山大学北校区动物中心)。
12 方法
121 海马神经细胞的分散、移植和培养 〔4〕，将乳鼠全身消毒后分层剪开头皮和颅骨，暴露两侧脑半球，分开颞叶皮层，暴露并取出海马回，置解剖液中；清洗后剪碎成糊状，0125%胰酶消化20min，终止消化后离心、过筛、CO2培养箱内培养。第2d更换无血清培养液，以后每隔2d换液1次，每次更换一半培养液。培养第2，3，4，5，6和7d在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
122 分组及染毒 设对照组、Pb组、Se组、Pb+Se组和先Pb后Se组。对照组加入30μl的磷酸盐缓冲液，Pb组加入30μl Na2SeO3，Pb+Se组同时加入PbCl2和Na2SeO3各30μl，先Pb后Se组于培养第2d换液时加入30μl的PbCl2，次日半量换液并加入30μl的Na2SeO3。使PbCl2、Na2SeO3的终浓度分别为1×10-5mol/L和2×10-6mol/L。以后换液时补入相应量的PbCl2或Na2SeO3，维持终浓度不变。
123 神经元存活率的测定 每次到培养的时间终点，收集细胞，洗涤定容后取10μl细胞悬液台盼兰拒染法进行镜下活细胞计数，获得各个剂量组不同时间终点的活细胞总数，再分析与同一观察时间的对照组的活细胞总数，比较各组细胞的相对存活率。
124 神经元突起的测定 倒置显微镜下(200×)，随机选择3个视野，利用图像自动分析仪测量形态可辨的所有神经元突起的长度。
2 结果
21 海马神经元形态观察 对照组和单独硒作用组的海马神经元镜下呈圆形，体积小，透亮，散在分布；培养2h后开始贴壁，6h后绝大部分细胞已贴壁，光晕明显；12h细胞几乎全部贴壁，且长出短小的突起；2d后细胞有明显增长的突起，胞体饱满多数呈梭形、锥形，胞浆丰富，核大，核仁隐约可见，背景中可见极少数扁平状多边形的神经胶质细胞铺垫；5～6d细胞相互间搭连成片，胞体间突起连接成网状逐渐明显；7d神经元数目不等地聚集成团，突起联结成网。与对照组比较，单独硒作用组的神经元胞体更丰满，神经元突起更长、更粗壮。铅单独作用组(10-5mol/L)的神经元生长改变情况如下：(1)贴壁减少：24h后，培养基中悬浮细胞数目较对照组多，贴壁细胞数减少，致使细胞在培养皿底部分布不均匀；(2)生长迟缓：第3d与对照组比较，散在分布的小体积圆形透亮细胞仍然较多，形态和大小与细胞刚种植时的情形无明显差别；(3)出芽延迟：对照组12～24h即可见短小突起，铅细胞种植后第2d才开始看见细胞变成梭形，伸出短小突起；(4)碎片增多：倒置显微镜下的视野中悬浮细胞和死亡细胞的碎片较多，培养后第7d，培养皿中的神经元已极其稀疏；(5)成团提前：正常神经元在本培养条件下第7d可见明显的成团现象，铅组于第4d即可见神经元细胞5～10个聚齐成团，第5d可见成团细胞中间神经元边界模糊，核仁消失，部分出现裂解，第7d成团神经元消失，皿中细胞数目显著减少。铅硒同时作用组神经元生长的改变情况与铅作用组相似，也出现了贴壁减少、生长迟缓、碎片增多和成团提前的改变，但是二者不完全相同，铅硒同时作用组神经元出芽晚于对照组但较铅组早，培养第6和第7d，贴壁神经元数目明显较铅组多。先加铅后加硒作用组早期改变与铅组相同，但从培养第4d开始，与铅组相比，贴壁神经元数目增多，细胞碎片减少，突起较多且较为粗壮。
22 海马神经元存活率分析(表1) 表1可见，10-5mol/L铅引起神经元存活率明显下降；单独硒(2×10-6mol/L)对海马神经元存活率的影响不明显；铅硒同时孵育组，存活率最低，提示使用的硒作用剂量可能偏高。
表1 Pb、Se对海马神经元存活率的影响（略）
23 海马神经元突起长度分析(表2) 表2可见，10-5mol/L铅明显抑制了原代培养的海马神经元突起生长(P<005)，单独硒(2×10-6mol/L)作用有明显促进海马神经元突起生长的作用，尤其在神经元突起生长早期(P<005)；铅和硒共同孵育时，培养早期硒能拮抗铅对神经元突起延伸的抑制(P<005)，但随着培养时间延长，这种拮抗作用变得不明显。
表2 Pb、Se对海马神经元突起长度的影响（略）
注：与对照组比较，a P<005；与Pb组比较，b P<005；与Se组比较，c P<005
3 讨论
低剂量的铅一方面可以引起包括神经细胞在内的多种细胞发生凋亡〔4，5〕，另一方面可以通过多种途径引发神经元死亡〔6，7〕。因此，本研究所观察到的铅抑制体外培养的神经元的存活，应该是铅诱导神经元凋亡和诱发神经元坏死共同作用的结果。本次实验发现，硒对体外培养的海马神经元突起的生长有很明显的促进作用，但作用机制不清楚，硒是否在神经元生长发育过程中参与了对神经细胞粘附因子(NCAM)表达调控需进一步研究。本实验中未观察到硒对体外培养的海马神经元的存活有明显的影响。铅硒共育组较铅组在神经元突起长度上存在差异，尤其在生长早期，提示硒对铅抑制神经元突起生长具有一定的拮抗作用，至于这种拮抗作用随培养时间延长而逐渐减弱至不显著，认为可能与铅的毒作用剂量过高有关，从神经元存活率的结果也能反映这一点，由于高剂量的铅导致对神经元生长的累积毒效应已经超过了硒的拮抗能力。提示应进一步降低铅的毒作用剂量再进行观察研究。
〔1〕 Stewart WF,Stewat BS,Simon D,et al.Neurobehavioral function and tibial and chelatable lead levels in 543 former organolead workers［J］.Neurology,1999,52(8):1610-1617.
〔2〕 胡前胜，董胜璋，任铁玲，等.儿童齿铅与智商关系流行病学研究［J］.环境与健康杂志，1999，16(1)：16.
〔3〕 Nehru B,Dua R.The effect of dietary selenium on lead neurotoxicity［J］.J Environ pathol toxicol oncol,1997,16(1):47-50.
〔4〕 De la Fuente H,PortalesPerez D,Baranda L,et al.Effects of arsenic,cadmium and lead on the induction of apoptosis of normal human mononuclear cells［J］.Clin Exp Immunol,2002,129(1):69-77.
〔5〕 He L,Pobenz AT,Medrano CJ,et al.Lead and calcium produce rod photoreceptor cell apoptosis by opening the mitochondrial permeability transition pore［J］.J Bio Chem,2000,275:12175-12184.
〔6〕 Adonaylo VN,Oteiza PI.Lead intoxication:antioxidant defense and oxidative damage in rat brain［J］.Toxicology,1999,135:77-85.
〔7〕 李茂进.铅影响学习记忆的研究进展［J］.国外医学卫生学分册，2000，27(3)：139-143.
