以鼠尾胶为贴黏剂的小鼠淋巴管内皮细胞培养体系的建立
作者：章必成，王俊，赵勇，高建飞，郭燕，陈正堂
【关键词】 鼠尾胶；贴黏剂；内皮,淋巴管；细胞培养
Establishment of culture system for mouse lymphatic endothelial cells adhered to rattail collagen
【Abstract】 AIM: To establish a convenient, cheap and stable culture system for mouse lymphatic endothelial cells (LEC). METHODS: Mouse lymphangiomas in abdominal cavity were induced by incomplete Freunds adjuvant, then disrupted and digested to obtain LEC, which were cultured in the flask or plate previously coated with rattail collagen. Expressions of LEC specific markers, VEGFR3 and LYVE1, were identified by immunofluorescence. The proliferation activity of LEC was evaluated by 3HTdR incorporation efficiency and cell doubling time. The capability of LEC to form lymphatic vessellike structures was assessed by the in vitro lymphatic vessel formation assay. RESULTS: Mouse lymphangiomas in abdominal cavity were induced successfully by incomplete Freunds adjuvant, and more than 98% living LEC were harvested. The expressions of VEGFR3 and LYVE1 were positive in LEC. In the rattail collagen coated flask or plate, LEC grew well, with 3HTdR incorporation efficiency increasing obviously and cell doubling time being (42.7±3.2) h. In the gel formed by rattail collagen, LEC could form lymphatic vessellike structures. CONCLUSION: Mouse LEC culture system using rattail collagen as adhesive is a convenient, cheap and stable culture system.
【Keywords】 rattail collagen; adhesive; endothelium, lymphatic; cell culture
【摘要】 目的：建立一个简便、廉价和稳定的小鼠淋巴管内皮细胞（LEC）培养体系. 方法：应用不完全弗氏佐剂诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成，消化法分离获得LEC，置于自制的鼠尾胶包被的培养瓶（板）中培养. 以免疫荧光化学法检测LEC特异性标记物VEGFR3和LYVE1的表达，以3HTdR掺入率测定和细胞倍增时间检测LEC的增殖活力，以淋巴管形成试验判定LEC能否形成淋巴管样结构. 结果：不完全弗氏佐剂能诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成，所获LEC活细胞数大于98%. 免疫荧光化学检测表明， LEC表达VEGFR3和LYVE1. 在鼠尾胶包被的培养瓶（板）中， LEC生长状况良好， 3HTdR掺入率明显增加，倍增时间为（42.7±3.2） h；在鼠尾胶凝胶中，LEC能形成淋巴管样结构. 结论：鼠尾胶为贴黏剂的体系是一种简便、廉价和稳定的小鼠LEC培养体系.
【关键词】 鼠尾胶；贴黏剂；内皮,淋巴管；细胞培养
0引言
淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LEC）是构成淋巴管壁的主要结构，参与维持体液平衡、调节淋巴细胞再循环和机体免疫反应等生理过程. 近年研究表明，LEC还在伤口愈合、淋巴管水肿和炎症扩散等病理过程中起重要作用，而且与肿瘤转移密切相关［1］. 但是，由于原代分离和体外培养LEC均比较困难，国内外有关此方面的报道较少，且多集中于牛、猪等大型动物和人身上，因此大大限制了人们对LEC的认识和研究. 我们应用不完全弗氏佐剂诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成为细胞来源，以自制鼠尾胶作为贴黏剂培养LEC，旨在建立一个简便、廉价和稳定的小鼠LEC培养体系.
1材料和方法
1.1材料雌性健康Balb/c小鼠10只（第三军医大学大坪动物实验中心），4～6 wk龄，体质量（19.1±1.3） g；雄性健康SD大鼠2只（第三军医大学大坪医院动物实验中心），12 wk龄，体质量（230.4±15.4） g. 含多种生长因子的EBM2培养基（英国Cambrex公司）；胎牛血清（FBS，美国Hyclone公司）；不完全弗式佐剂（美国Sigma公司）；兔抗鼠VEGFR3抗体，兔抗鼠LYVE1抗体（美国Santa cruz公司）；FITC标记的羊抗兔IgG（武汉博士德公司）；3HTdR（北京原子能研究所）. 乌拉坦（1 mL/100 g）ip麻醉大鼠，剪下鼠尾，750 mL/L乙醇消毒3 min. 去皮，950 mL/L乙醇固定15 min. 抽出肌腱，750 mL/L乙醇消毒30 min，三蒸水反复冲冼以去除残余乙醇. 充分剪碎，移入三角烧杯，加入5 mL/L醋酸溶液200 mL，4℃摇动过夜. 次日吸取上层液体，4000 r/min离心30 min，收集上清即为鼠尾胶. 取少量鼠尾胶加入培养瓶中（以全部覆盖瓶底为宜），5 min后吸掉鼠尾胶，室温放置过夜以备培养LEC之用；按同法包被下述实验需要的培养板和制备爬片所需的盖玻片. 按［2］将不完全弗氏佐剂与PBS按1∶1混匀，制成乳悬液. 取8只小鼠，ip 0.2 mL；15 d后加强注射1次. 2 mo后处死小鼠. 另设2只小鼠注射相同体积的无菌PBS作为对照.
1.2方法打开小鼠腹腔，取出淋巴管瘤. 将其剪碎成约0.5 mm3大小，加入I型和II型胶原酶1∶1配成的1 g/L溶液5 mL，37℃恒温摇床消化组织块30 min，800 r/min离心10 min收集细胞，残余组织块用2.5 g/L胰蛋白酶＋0.2 g/L EDTA溶液37℃摇床消化15 min，离心收集细胞，将两次收集的细胞混合，80 μm尼龙网过滤，台盼蓝计数. 之后，将细胞接种到鼠尾胶包被的培养瓶中，使用含多种生长因子的EBM2完全培养基，37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养.
1.2.1LEC的鉴定取培养2～3代的LEC 1×106个接种于鼠尾胶包被的6孔培养板中，同时分别将鼠尾胶包被的盖玻片置于其中. 24 h后取出盖玻片，40 g/L甲醛固定20 min. 30 mL/L H2O2室温封闭10 min后，再用20 mL/L山羊血清封闭20 min. 分别以兔抗鼠VEGFR3抗体或LYVE1抗体和FITC标记的羊抗兔IgG为一抗和二抗进行免疫荧光检测，以PBS代替一抗作为阴性对照.
1.2.2LEC的增殖活力测定取培养2～3代的LEC于实验前晚半量换液，实验时取1×106个，以不含FBS和生长因子的培养液洗涤3次，最后将细胞悬浮于0.5 mL完全培养液中；加3HTdR 370 kBq，放入孵箱孵育3 h，每0.5 h轻摇1次；标记结束时加FBS数滴，洗去游离同位素，加完全培养液洗浴30 min，调整细胞密度2×108/L备用. 取LEC 0.25 mL/孔（5×104/孔）接种于鼠尾胶包被的24孔板，随机分组为：①空白对照组（使用不含生长因子和FBS的EBM2培养基）；②无生长因子组（使用只含FBS的EBM2培养基）；③无FBS组（使用只含生长因子的EBM2培养基）；④完全培养基组（使用既含生长因子又含FBS的EBM2培养基）. 在孵箱中作用20 h后，低速离心5 min，轻弃上清0.1 mL；加混合酶（8 g/L胰蛋白酶与0.5 g/L DNA酶在作用前对倍稀释而成）0.1 mL，作用30 min后，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，烘干后放入闪烁杯送检cpm，换算成Bq，代表3HTdR的掺入量，反映LEC的增殖状况. 每份设3个复孔，取其平均值. 另按1×104/孔接种LEC于24孔培养板，分别在1，6，12，24，48，72，96，120 h取3孔计数活细胞（4 g/L台盼蓝拒染），实验重复3 次，取其平均值，绘出生长曲线，并按公式DT=t log2/(log Nt-log No)计算其细胞倍增时间. t表示对数生长期细胞培养时间，Nt为对数生长期终末时的细胞数，No为对数生长期起始时的细胞数. 以未用鼠尾胶包被的培养孔作为对照.
1.2.3淋巴管形成试验先将鼠尾胶铺满6孔培养板底部，置浓氨水棉球片刻，1 h后即形成胶原凝胶. 每孔接种1×105个LEC，补加完全培养液适量，置于37℃，50 mL/L CO2孵箱培养. 每天使用相差倒置显微镜观察淋巴管样结构形成的情况. 以未用鼠尾胶包被的培养孔作为对照.统计学处理：计量资料以x±s表示，采用统计软件SPSS 11.0分析，组间比较用非参数秩和检验.
2结果
注射不完全弗式佐剂2 mo后，在沿着小鼠胸导管膈肌腹腔面、肝脏表面及侧腹壁腹腔面可见白色肿瘤样组织，即为诱导形成的淋巴管瘤. 瘤体大小10～500 mm3，与周围组织分解清楚，较易剥离. 实验组成瘤率100%，而对照组未见白色肿瘤样组织. 使用台盼蓝计数显示分离得到的LEC活细胞数大于98%. LEC在鼠尾胶包被的培养瓶中培养6 h后大部分贴壁，呈圆形或椭圆形. 培养1 d左右，LEC完全贴壁，并开始铺展；2～3 d可见细胞分裂增殖形成散在细胞群落；4～5 d细胞紧密排列，连接成片，互不重叠，呈典型的铺路卵石样结构，并有接触抑制现象（图1）. 传到第8代时，LEC伸展变长，发生形态改变.
2.1LEC的鉴定在荧光显微镜下观察到，VEGFR3（图2A）和LYVE1（图2B）均在LEC胞膜和胞质中表达，呈现出黄绿色的亮光环反应.
2.2LEC的增殖活力测定空白对照组、无生长因子组、无FBS组和完全培养基组的3HTdR掺入率（Bq）分别为26.2±4.0，487.2±44.8，508.6±41.2和3597.2±366.5. 经统计学处理，完全培养基组的3HTdR掺入率与其他三组之间均存在统计学差异（P<0.01），而无生长因子组和无FBS组之间未见统计学差异（P>0.05）. 说明LEC的生长需要生长因子和FBS，两者缺一不可；而且得到的LEC具有良好的增殖活力. 另在鼠尾胶包被的培养孔中，LEC生长良好，细胞倍增时间为（42.7±3.2）h. 而在未用鼠尾胶包被的培养孔中，LEC几乎停止生长. 说明鼠尾胶包被培养板有利于LEC生长；而且得到的LEC具有良好的增殖活力.
图1－图2 略
2.3淋巴管形成试验在鼠尾胶凝胶中，接种LEC 15 d后开始出现淋巴管样结构，含有明显的管壁和管腔，逐级分支（图3）. 而在未用鼠尾胶包被的培养孔中，20 d仍未出现淋巴管样结构. 说明LEC在鼠尾胶凝胶中具有形成淋巴管样结构的生物学特性.
3讨论
作为淋巴系统的功能细胞，LEC的生理功能、病理改变和分子水平的调节等与肿瘤转移、炎症扩散等疾病进程密切相关. 但是，迄今为止，尚未建立起一个简便、廉价和稳定的小鼠LEC培养体系. LEC与血管内皮细胞均由内皮祖细胞分化而来，属于锚着依存性细胞，呈贴壁性生长，因此需要在培养容器底部覆盖贴黏剂以增加细胞的贴壁性； 体外培养的LEC图3在鼠尾胶凝胶中LEC形成淋巴管样结构×100形成淋巴管样结构时也需要基质来支持［3］. 由于LEC的生物学特征不完全同于血管内皮细胞，虽然很早就建立了比较稳定的血管内皮细胞系，但是一直没有商业化的LEC系［4］. 直到最近，Sironi等［5］才以明胶为贴黏剂成功的建立了小鼠LEC系. 商品化的贴黏剂如明胶、基质胶、多聚赖氨酸和纤维连接蛋白等均价格昂贵. 鼠尾胶的主要成分为I型胶原，与细胞外基质的主要成分一样，虽然并无营养细胞的作用，但仍不失为体外细胞培养的良好基质. 由于具有成本低廉、取材方便和黏附力强等优点，很多作者将鼠尾胶用于培养脑星形胶质细胞、皮肤角朊细胞和前庭毛细胞等. 蔡莉蓉等［6］曾以鼠尾胶为贴黏剂成功的培养了微血管内皮细胞. 由于许多细胞在I型胶原中培养可获得与机体相似的组织形态，如颌下腺上皮细胞、乳腺上皮细胞可分别增殖分化形成腺管样结构，因此鼠尾胶也常被用于管状结构新生模型的研究. 李明焕等［7］发现在鼠尾胶中，人脐静脉内皮细胞在生长因子的刺激下，可以形成树枝状毛细血管样结构. 此外，鼠尾胶也常被用于研究肿瘤细胞的侵袭性.
我们首先以不完全弗式佐剂诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成，发现此法成瘤率高，重复性好，分离得到的小鼠LEC数量多，活力强，是获得小鼠LEC的理想方法. 单层铺路卵石样排列和接触抑制是内皮细胞的重要生长特性，我们得到的LEC完全符合此特点，并被VEGFR3和LYVE1等标记物所证实. 之后，通过3HTdR掺入率测定、细胞倍增时间测定和淋巴管形成试验等证明，本研究得到的LEC具有良好的增殖能力和形成淋巴管样结构的能力. 总之，本研究中我们建立的以不完全弗式佐剂诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成为细胞来源、以鼠尾胶为贴黏剂的体系是一种简便、廉价和稳定的小鼠LEC培养体系.
【】
［1］ Achen MG, Mann GB, Stacker SA. Targeting lymphangiogenesis to prevent tumour metastasis［J］. Br J Cancer, 2006, 94(10): 1355-1360.
［2］ 周宏志, 顾晓明, 王春梅. 小鼠淋巴管瘤的诱导与组织病观察［J］. 第四军医大学学报, 2002, 23(4): 295-297.
［3］ Religa P, Cao R, Bjorndahl M, et al. Presence of bone marrowderived circulating progenitor endothelial cells in the newly formed lymphatic vessels［J］. Blood, 2005, 106(13):4184-4190.
［4］ Ji RC. Lymphatic endothelial cells, lymphangiogenesis, and extracellular matrix［J］. Lymphat Res Biol, 2006, 4(2):83-100.
［5］ Sironi M, Conti A, Bernasconi S, et al. Generation and characterization of a mouse lymphatic endothelial cell line［J］.Cell Tissue Res, 2006, 325(1): 91-100.
［6］ 蔡莉蓉, 李玉珍, 刘秀华. 鼠尾胶为贴黏剂的微血管内皮细胞培养［J］. 军医进修学院学报, 2005, 26(6): 464-465.
［7］ 李明焕, 田铧, 刘执玉, 等. ECV304细胞用于三维血管新生的研究［J］. 普通外科进展, 2004, 7(3): 165-167.
