乙肝病毒PreS1抗原的临床应用

【关键词】  乙肝病毒;,DNA;,PreS1抗原;,临床意义

　　Clinical application value of HBV PreS1 antigen　　

       【Abstract】 AIM: To evaluate the clinical significance of detecting PreS1 antigen of  hepatitis B virus (HBV). METHODS: HBsAg positive serum specimens (n=1000) from inpatients and outpatients were collected, then detected for PreS1 antigen and HBV DNA by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQPCR). RESULTS: The total PreS1 positive rate was 52.0%, the HBVDNA positive rate was 50.8%, and the HBeAg positive rate was 21.0%. The total positive rate of PreS1 was higher distinctly than that of HBeAg. The total accordance rate between PreS1 and HBVDNA was 94.4%. CONCLUSION: PreS1 is more sensitive than HBeAg when as a serological index of HBV infection and reproduction. Determination of PreS1 has a great application value in diagnosis and treatment of hepatitis B. PreS1 could be taken as a new serological indicator for infectivity and replication of HBV.

　　【Keywords】 HBV; DNA; PreS1; clinical significance

　　【摘要】 目的：评价检测乙肝病毒PreS1抗原的临床应用价值. 方法：将临床送检的1000份乙肝病毒表面抗原（HBsAg）阳性的血清标本进行PreS1抗原检测，同时用FQPCR进行HBVDNA测定. 结果：PreS1总阳性率为52.0%，HBVDNA阳性率为50.8%，HBeAg阳性率为21.0%. PreS1总阳性率明显高于HBeAg阳性率. PreS1与HBVDNA的总符合率为94.4%. 结论：PreS1抗原作为乙肝感染和复制的血清学指标敏感性高于HBeAg，对提示乙肝患者的病情和转归有重要临床意义. PreS1可以作为一项新的乙肝病毒复制的传染性指标.

　　【关键词】 乙肝病毒; DNA; PreS1抗原; 临床意义

　　0引言

　　随着实验诊断学的发展，乙肝病毒的血清学指标不断得到发展完善，PreS1作为一项新的乙肝病毒感染的血清学标志物越来越被临床重视. 近年发展起来的荧光定量PCR技术(fluorescence quantitative polymerase chain reaction assay, FQPCR)广泛应用于乙肝病毒DNA的测定，为乙肝病毒的感染、复制及具有传染性提供了最直接的依据. 本研究我们将乙肝病毒表面抗原阳性的血清标本同时进行PreS1和DNA测定，评价PreS1作为一项乙肝病毒新的血清学标志物的临床意义.

　　1对象和方法

　　1.1对象将西安大学第二附属病房和门诊送检的疑诊为乙型肝炎的患者，并要求作乙肝系列检查，经检测HBsAg为阳性的血清标本收集，共计1000（男585，女415）份. 年龄1~78 a. 正常对照组50(男女各25)例，年龄12~58 a,来自门诊部正常查体的标本，其乙肝五项标记除表面抗体可为阳性外，其余四项皆为阴性. 所有患者均采集静脉血，血清经分离后及时检验，或分装于高压灭菌的1.5 mL Eppendorf管，于-20℃冻存.

　　主要试剂: HBVM试剂购自上海实业科华生物技术有限公司. 质控血清购自卫生部临床检验中心. PreS1试剂由院生物化学与细胞生物学研究所上海阿尔法生物技术有限公司提供. HBVDNA试剂盒由中山医科大学达安基因诊断中心生产. 引物为   P1: 5′ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TT3′；　　　　　P2: 5′ACA GTG GGG GAA AGC CCT ACG AA3′. 探针：荧光标记的探针(FProbe)序列为　　　　　5′RTGG CTA GTT TAC AGT GCC ATT TGQ3′,R为报告荧光基团;  Q为表淬灭荧光基团.

　　主要仪器: 瑞士Ausbio生产的“酶免之星”全自动免疫分析仪. 美国PE公司生产的PE5700全自动实时荧光定量PCR扩增仪(包括一台9600型热循环仪、荧光光源、检测系统及电脑、应用软件).

　　1.2方法

　　1.2.1乙肝病毒血清标志物（HBVM）的检测采用上海实业科华生物技术有限公司生产的EIA立可读一步法试剂盒，按照说明书的操作步骤及阴阳性判断标准进行编程，其中，HBsAg,HBsAb,HBeAg为夹心法，HBeAb为竞争抑制法，HBcAb为中和抑制法. 运用“酶免之星”全自动免疫分析仪，进行检测，试验结果由仪器自动读出. 每次实验都加作室内质控，确保实验结果准确可靠.

　　1.2.2PreS1抗原测定按照上海阿尔法生物技术有限公司提供的ELISA操作步骤和结果判定方式进行编程，该实验为两步法，采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法，以固相化的人工化学合成的前S1蛋白21~47aa肽进行免疫制备前S1蛋白单抗捕获标本中的乙肝前S1抗原，辣根过氧化酶标记的抗PreS1单抗为二抗来检测PreS1抗原，同样采用全自动免疫分析仪进行检测.

　　1.2.3HBVDNA测定FQPCR反应步骤如下：常规碱裂解法从血清中提取HBVDNA, 0.2 mL薄壁反应管中50 μL反应液含1.0 μmol/L引物、0.1 μmol/L的荧光探针(FProbe)，200 μmol/L的脱氧核糖核酸、50 nkat Taq DNA聚合酶及1×缓冲液. 将待检DNA样本或标准阳性模板加入后,放入PE5700荧光PCR仪,93℃ 2 min预变性后,按93℃ 45 s和55℃ 60 s,先做10个循环，最后按93℃ 30 s和55℃ 45 s反复30个循环. 同时用拷贝数为1×105, 1×106, 1×107, 1×108/L定标液进行扩增，以扩增前后的荧光差值为纵坐标，拷贝数为横坐标，用ABI7000自动作标准曲线，由电脑软件自动出样本HBVDNA初始拷贝数定量结果. 由于PreS1，HBVM检测结果均为定性结果，因此将HBVDNA检测结果用定性方式表示（拷贝数＜106/L为阴性，≥106/L为阳性）.
　　
　　统计学处理：采用SPSS8.0统计软件,计数资料采用χ2检验,显著性检验水准为α=0.05.

　　2结果

　　2.1HBVM不同组PreS1抗原检测在HBsAg阳性血清中，PreS1总阳性率为52%，而正常对照组50例全为阴性，阳性率为0. 说明PreS1抗原作为一项HBV感染的血清学指标的初步可行性. HBeAg阳性的HBVM第①和第④组PreS1阳性率较高（表1）.

　　2.2HBeAg阳性组与阴性组PreS1抗原检测在上述研究基础上，将HBeAg阳性组和阴性组PreS1抗原检测结果进行比较，χ2=98.3，P<0.01，差异有统计学意义，HBeAg阳性组PreS1抗原检出率明显高于HBeAg阴性组(表2).

　　HBeAg和PreS1总符合率为61.6%，说明两者有较好的一致性和相关性，由于HBeAg是HBV复制活跃和传染性指标，本研究显示两者有很高的阳性符合率，可以把PreS1抗原作为判断HBV病毒复制的血清学指标.

　　表1HBVM不同组PreS1抗原检测结果　略

　　表2HBeAg与PreS1Ag检测结果　略
　
　　2.3PreS1Ag检测结果与HBVDNA结果PreS1测定结果与HBVDNA结果比较有一定差异(表3).

　　表3PreS1Ag和HBVDNA检测结果比较　略

　　从表中可以看出： HBVDNA的总阳性率为50.8%， 与PreS1的总符合率为94.4%， 两者有很高的一致性,差异有统计学意义(χ2=788.8， P<0.01). 检测HBVDNA作为目前诊断是否具有传染性和病毒处于复制期的金标准， 由于PreS1和HBVDNA两者之间有极高的相关性和一致性， 所以PreS1可以作为一项判断乙肝病毒是否复制和具有传染性的血清学新指标.

　　3讨论

　　在研究过程中，由于HBsAg阴性的血清标本在本实验室从未检测出HBVDNA阳性，所以本研究只讨论HBsAg阳性标本. 对于单独核心抗体阳性而检测到阳性病毒DNA的，经重复稀释标本检测表面抗原，证实为阳性，原倍检测阴性是由于前带现象引起. 目前，国内检测HBsAg绝大多数应用ELISA中双抗体夹心双位点一步法，当标本中HBsAg含量过高时，会因钩状效应出现而引起假阴性［1］. 由于HBVM检测所用的试剂为一步法，抗原抗体反应会产生“钩状效应”而产生假阴性结果，PreS1抗原检测是两步法，避免了“钩状效应”的产生，同时检测HBVM、PreS1能够起到相互提示作用，最大程度减少假阴性结果的产生.
　　
　　乙型肝炎病毒的PreS1抗原是由PreS1基因编码的外壳表面抗原蛋白成分之一，与HBV的组装、分泌和入侵肝细胞密切相关，可作为乙肝病毒活动性复制的指标［2］. PreS1抗原的持续存在表明病毒复制和病毒颗粒存在. 我们发现，在HBeAg阳性组较阴性组PreS1检出率高，表明PreS1抗原与HBeAg存在密切相关. 本研究证明，HBV的传染性与乙肝病毒PreS1抗原阳性率具有一致性，在HBVM中HBsAg, HBeAg是HBV在进行复制、包装过程中产生的蛋白成分，HBsAg存在并不一定表示有传染性，而HBeAg是HBV核心内部成分，可作为体内HBV处于复制状态的标志.
　　
　　PreS1不仅是HBV感染的标志还是HBV复制的依据，在HBV感染早期既可以检出［3］. 从试验结果可以看出，在受检者血清中，部分HBeAg阴性，但PreS1和HBVDNA为阳性，可见，HBeAg阴性并不意味着乙肝病毒复制的完全终止或病毒血症的消失，所以对于HBeAg阴性而HBsAg阳性的标本，应该检测PreS1抗原和HBVDNA，来判断是否存在HBV感染或复制. PreS1能够敏感地反映乙型肝炎病毒的复制情况，尤其可以反映HBeAg阴性的乙型肝炎患者是否有病毒复制. 在急性乙型肝炎患者中，PreS1先于HBVDNA阴转，提示疾病预后良好［4］. 尽管PreS1和HBVDNA有很好的相关性，仍有部分标本PreS1抗原阳性而HBVDNA阴性，说明PreS1抗原的检测并不能完全替代HBVDNA的检测. 有关两者检测结果不一致的原因，还需进一步研究.
　　
　　HBV是DNA病毒，检测HBVDNA是判断HBV复制最直接的指标，FQPCR方法是目前检测HBVDNA最有效、最准确的方法. 但是，此方法对实验室要求条件较高，一般基层医疗单位还很难开展. 而PreS1检测方法简单，本研究证实PreS1可以作为一项乙肝病毒感染、复制的诊断、预后血清学指标，与HBVDNA有很好的一致性，具有较高的临床应用价值，可以作为常规检验项目.
　　
　　综上所述，HBVM，HBVDNA和前S1抗原之间的检测结果有相互关联，但所表达的临床意义并不完全一致，对不同类型HBV感染患者前S1抗原，HBVDNA和HBVM联合动态检测有助于临床诊断、疗效观察及预后判断. HBVDNA和HBeAg是反映HBV感染复制的重要标志，PreS1抗原不仅是反映病毒复制的标志，而且比HBeAg敏感性更高，有很好的独立价值. PreS1抗原在乙肝的临床诊断及疗效观察等方面中起到重要作用，对HBVM，HBVDNA的检测有重要的补充作用. 同时还可以作为输血前常规检查，可以很大程度减少输血后肝炎的发生.

　　【参考】

　　［1］ 单桂秋，李秋生，肖韶英. 检测乙型肝炎表面抗原的一步法试剂的钩状效应分析［J］. 中华检验医学杂志， 2002， 25(2)： 107-108.

　　［2］ Hu WG, Wei J, Yang XX, et al. Expression of overlapping PreS1 fragment recombinant proteins for the determination of immunogenic domains in HBsAg PreS1 region［J］. Acta Biochim Biophys Sin, 2004, 36(6): 397-404.

　　［3］ Jin ZZ, Li MH, Wang YS, et al. Binding site of hepatitis B virus preS1 region to the asialoglycoprotein receptor of human liver［J］. J Med Yanbian Univ, 2002,3:157-160.

　　［4］ 闵福援，孙桂珍，王健，等. 前S1蛋白在乙型肝炎诊断及判断预后中的作用［J］. 中华检验医学杂志, 2004， 27(4)： 224-226.

　　［5］ 许丽雅，王琼. HBV感染者血清HBV PreS1抗原检测与病毒复制的关系［J］. 浙江医学，2004，26（9）：652-653.