多发性脑梗塞性大鼠模型制作及其意义
作者：车光升，周郦楠，张晖，张维，张晔
我国是脑血管疾病发病率较高的国家，近年来，随着人民物质生活水平的不断提高，老龄化人口的增加，发病率呈迅速上升趋势。脑血管疾病以高发病、高致残、高死亡而严重影响人类健康，而多发性脑梗塞(Multiple Cerebral Infarction,MCI)发病率占有相当大的比重。迄今为止，MCI的发病机制不完全清楚，尚无十分有效的手段，因此，研究其发病机制、防治措施具有重要意义。本实验建立的动物模型可为临床治疗该疾病提供实验室动物实验模型条件，为临床研究新药物提供实验室理论依据〔1〕。
1 材料与方法
1?1 材料 雄性Wistar大鼠(医科大学动物室)；LUZEX-F显微图像分析仪(日本松下公司)；日立H-600透射电镜；恒冷箱切片机。雄性Wistar大鼠60只，体重260～300g，随机分成3组。对照组20只(10只用于电镜染色，10只用于电镜观察)；MCI模型光镜组20只；MCI模型电镜组20只。
1?2 方法
1?2?1 MCI模型制备 用1%戊巴比妥钠(40ml/kg)腹腔注射麻醉后，作颈部正中切口，暴露左侧的颈总动脉，分别先后寻找颈内动脉与颈外动脉分叉处，做翼腭动脉结扎，并对颈外动脉充分剥离。在颈总动脉及颈内动脉远心端，分别用无损伤的显微外科血管动脉夹做可逆性夹闭。同时剪开颈外动脉，插入套管针，拔出针芯，将其尖端插到距颈总动脉分叉约2mm处，放开颈内动脉的血管夹，注入肝素盐水0?2ml(含肝素10U)，2?5%同种属大鼠全血悬浊液(将同种导体大鼠全血晾干研磨成细粉200μm筛孔过筛备用，放置冰箱，应用时用0?9%生理盐水配置)0?5ml。注射完毕，立即将颈外动脉结扎，与此同时，放开颈总动脉的血管夹、观察、逐层缝合。
1?2?2 光镜组动物模型取材 对实验动物用1%戊巴比妥钠(40ml/kg)腹腔麻醉后开胸，经左心室70滴/min滴入1%肝素钠的生理盐水500ml，同时剪开右心耳。继续用0?1mol磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7?4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出实验动物的大脑组织，放入含4%多聚甲醛的固定液中进行后固定大约2h，之后将实验动物的大脑组织切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至组织薄片沉底，经水包埋，恒冷箱连续横切片，片厚20μm。
1?2?3 尼氏染色方法〔２〕 冰冻切片吹干，经PBS漂洗5min×3次，将切片置入1%甲苯胺蓝溶液中，37℃孵育90min，取出后用蒸馏水冲洗，PBS漂洗5min×3次，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。
1?2?4 透射电镜组模型取材 实验对照组大鼠在1%戊巴经妥钠(40ml/kg)腹腔麻醉下，经左心室灌注含1%肝素钠的生理盐水300ml快速冲洗后，用2%多聚甲醛及2?5戊二醛的0?1mol磷酸缓冲液250mol灌流固定，灌流后立即取脑，切取海马组织块置于4℃，2?5%戊二醛中固定24h,再经1%锇酸固定1h后，常规脱水，包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，日立H-600透射电镜观察并拍片。
2 结果
2?1 尼氏染色结果 在对照组切片中可见大脑皮质各个层的细胞质呈蓝色，细胞形态正常，细胞数量较多，排列紧密，胞浆内尼氏体丰富；而在MCI模型光镜组中可见大脑皮质受损细胞遍及各层，但锥体细胞层更为明显，细胞数量减少，细胞排列紊乱，细胞形态改变，肿胀或皱缩，细胞坏死崩解，溶解成碎片，由于变性坏死的细胞较多，细胞层明显变薄，见图1～4。
图1 正常对照组大鼠海马区神经元细胞(尼氏染色，×250)（略）
图2 正常对照组大鼠海马区神经元细胞(尼氏染色，×1000)（略）
图3 实验组大鼠海马区神经元细胞(尼氏染色，×250)（略）
图4 实验组大鼠海马区神经元细胞(尼氏染色，×1000)（略）
2?2 电镜超微结构观察 在对照组切片中可见大脑皮质各个层的细胞的细胞膜、细胞核及细胞质中的细胞器均为正常；而在MCI模型电镜组中可见大脑皮质受损细胞遍及各层，神经元出现明显的损伤性改变：核皱缩、核膜部分溶解消失、线粒体肿胀、嵴紊乱甚至缺失、线粒体出现空泡样变，内质网扩张、粗面内质网脱颗粒；高尔基复合体扩张，突触数量减少、前后膜融合、突触小泡不清或出现聚集，见图5，6。
图5 实验组大鼠海马区神经元线粒体空泡样变(×20 000)（略）
图6 实验组大鼠海马区神经元线粒体嵴紊乱(×15 000)（略）
3 讨论
根据尼氏染色和透射电镜结果证明，MCI动物模型制备成功。以往的研究中，仅能从事脑内某一局部的梗塞研究，由于缺乏多发性脑梗塞的实验室动物模型，不能从事多发性脑梗塞疾病的临床药物在实验室内的研究工作，该模型的制备成功，为实验室内研究多发性脑梗塞药物提供了动物模型，也为药物临床治疗MCI提供可靠的实验室依据。实验室内可以依据动物模型的病改变而对药物进行筛选，为临床治疗多发性脑梗塞提供可靠的实验室依据。
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〔1〕 周郦楠，李沁彤，杨平.MCI海马CA1，区AChE的变化及NGF和Svate-3联合应用对MCI影响的实验研究［J］.断层影像解剖学杂志，2000，4(1)：17-20.
〔2〕 梁晓俐.病理学基础与实验技术［M］.北京：军事医学科技出版社，2004：129-130.
