乙型肝炎病毒相关性原发性肝癌患者前?X基因的分子流行病学意义

【摘要】  　　目的：了解前?X基因在HBV相关HCC患者中的流行病学分布、前?X基因和HBV基因型与HCC的临床关系. 方法： 患有乙肝的肝细胞肝癌患者（HCC）35例，采用型特异性引物巢式聚合酶链反应进行基因分型. 同时对明确基因分型的肝癌患者，扩增前?X区，TA克隆到PMD18?T载体后进行单克隆测序，分析前?X区在肝癌患者的表达情况，对前?X区和基因型及相关病情进行研究. 结果： HCC患者35例中B基因型1例，C基因型24例，B/C混合基因型8例，未定型者2例. 明确基因型的患者33例，进一步扩增前?X区，并经TA克隆获得93个单克隆株中，经测序表明，有65个单克隆株编码前?X多肽，占69.9%. HCC患者33例中有29例编码前?X多肽，编码率为87.9%，高于慢性乙型肝炎患者58.8%的编码率. C基因型前?X多肽编码率为91.6%，B/C混合型编码率为87.5%（P>0.05），B基因型无编码. 前?X区的表达与年龄，性别，家族史，AFP，HBV DNA，ALT水平间无关（P>0.05）. 结论： HCC患者中C基因型、B/C混合基因型较为多见. 前?X多肽在HCC患者中有较高的编码率，前?X区多肽可能和HCC之间有一定相关性.

【关键词】  肝炎病毒 乙型 基因型 前?X基因 癌 肝细胞

     0引言

    乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）在其负链上含4个部分重叠的开放读码框架（open reading frame, ORF）即前S/S区、前C/C区、P区和X区，分别编码7种性质不同的蛋白如HBcAg，HBeAg，HBsAg等. 有研究表明，X 区编码的HBxAg与肝细胞肝癌（HCC）的形成密切相关［1］. 研究证实，在X ORF的上游还存在一个新的ORF即前?X ORF［2］，而关于其的功能研究尚不多见，是否具有类似功能尚不确定，我们对前?X ORF功能进行初步探讨.

    1对象和方法

    1.1对象2004?01/2004?12 HBV DNA阳性的HCC患者35例. 所有患者均经B超、CT和核磁共振（MRI）或血管造影等临床诊断为乙肝相关性肝癌，采用蛋白酶K、酚?氯仿?异戊醇法提取血清HBV DNA. 乙肝标志物(HBV?M：HBsAg，Anti?HBs，HBeAg，Anti?HBe，Anti?HBc）的测定均采用ELISA法检测，试剂由华美生物工程有限公司提供. 生化指标（ALT）由我院全自动生化检测仪常规测定.

    1.2方法通过比对不同HBV基因型序列以及Natio［3］等设计的6种主要基因型的分析方法，设计了共同的外引物P1, P2，进行PCR扩增，并以扩增产物为模板进行基因型特异性内引物扩增. 基因型特异性内引物扩增分为A，  B两组，其中A组包括共有的上游引物P3, PA（基因型A特异性下游引物）, PB（基因型B特异性下游引物），PC(基因型C特异性下游引物），B组包括上游引物P4以及基因型D, E, F的特异性下游引物PD, PE, PF，同时行PCR扩增. 取第2轮PCR扩增产物5 μL经过20 g/L琼脂糖凝胶电泳后判断HBV基因型，根据电泳结果判断HBV基因型.

    　　以35例HCC患者中明确HBV基因分型的33例患者HBV DNA溶液为模板，根据前?X上游引物Px1,下游引物为Px2，扩增前?X区［4］. Px1下游第31?33 nt处为前?X区起始密码子ATG，Px2上游30?32 nt处为X区起始密码子ATG，扩增的靶区域全长231 nt，其中前?X区全长为168nt. 将PCR产物回收并连接至PMD 18?T载体，将连接好的重组体转入感受态细胞，经氨苄青霉素（Amp）和X?gal蓝白斑法初步筛选阳性菌落，进一步提取质粒采用PCR法鉴定. 对经过鉴定的成功导入前?X基因的菌落送测序.

    　　统计学处理：所有数据应用SPSS13.0统计软件分析，不同组间率的比较采用χ2检验，均数比较采用t检验. P<0.05表示有统计学意义.

    2结果

    2.1HBV基因型应用该基因型分型方法，A组PCR产物电泳时A基因型为68 bp，B基因型为281 bp，C基因型为122 bp（图1）;B组电泳时D基因型为119 bp，E基因型为167 bp，F基因型为67 bp. 本组的35例患者中，B基因型1例，C基因型24例，B/C混合基因型8例，未定型者2例，未见其他基因型. 

     2.2前?X基因PCR扩增扩增的靶区域全长231 bp，成功构建出PMD18?T?前?X载体后，以PMD18?T载体上游引物M13和Px1为上游引物、Px2为共有的下游引物同时行PCR扩增，可得到308 bp和231 bp的片断，说明克隆成功.

     2.3前?X基因序列分析经鉴定成功导入重组体的菌落，随机共选取93株送测序. 前?X ORF全长168 bp，位于测序片断的第31位至第198位，根据其测序结果推定核苷酸序列如下：

    ATGGGGCTTGGCTATTGGCCATCGCCGCATGCGTGGAACCTTTGTG

    GCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGC

    TCGCAGCCGGTCTGGAGCGAAACTTATCGGAACCGACAACTCTGTT

    GTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCC；

    在这93个克隆中有65个克隆在第31~33 bp处为ATG，而该位点即为前?X基因的起始位点，是成功编码前?X多肽的关键所在，占所测核苷酸序列的69.9%. 而经过进一步分析发现，在前?X基因全长168 bp中未发现终止密码子的出现，导致其余28个单克隆不能编码前?X多肽的原因在于该位点出现了A→C替换突变，使其不能正常编码.

    2.4前?X多肽在HCC中的分布来自同一例患者的不同单克隆中，只要有一个单克隆可以编码前?X多肽，就认为该患者可以表达前?X基因. 在来自已知基因分型的33例HCC患者，随机选取的93个单克隆中，有65个克隆可以编码前?X多肽，分别来自29例患者；而在剩余的28个单克隆株中，有3个单克隆来自同一患者，而相同的情况还出现在另外3个患者，即共有4例患者被认为不能成功编码前?X多肽.

    2.5前?X基因分析在已知基因分型的33例患者中有B基因型1例，C基因型24例，B/C混合型有8例. 1例B基因型患者中3个单克隆株皆未表达前?X多肽、24例C基因型患者中有50株72.5%（50/69），8例B/C基因型患者有15株71.4%（15/21）能成功编码前?X多肽，即24例C基因型患者中有22例可以编码前?X区，约占91.6%，8例B/C 混合型患者有7例可以编码前?X区，约占87.5%. 因B基因型例数较少，仅对C基因型、B/C混合基因型进行分析，前?X区在C基因型、B/C混合基因型中表达率无统计学差异. 与既往慢性乙型肝炎人群中做的前?X基因调查结果相比较［4］，前?X基因在HCC患者中的表达率高于CHB人群,前?X区在不同人群中分布有所不同，在HCC人群中表达率较高（表1）. 根据前?X基因的表达与否将其分为2组，研究前?X区与临床相关资料如年龄、性别、家族史、乙肝标志物、HBV DNA等之间的关系（表2 ）.  表1前X基因在不同人群中的分布情况表2前?X基因与年龄、家族史、性别的关系

    3讨论

    HCC的发生是一个多基因、多途径的复杂多阶段过程. HBsAg阳性者进展为HCC的危险性比HBsAg阴性者增加了100倍以上. 目前对HBV长期感染导致HCC发生的具体机制尚不完全明确. 自Takahashi等［5］于1995年研究曾发现前?X区的存在外，近期有研究证实前?X区存在的确定性［6］，但关于前?X基因的功能研究较少［7］，为了更详细的了解前?X基因在HCC患者中的表达情况，明确前?X基因与HCC的发生有无相关性，对进一步研究前?X区的功能提供一个方向，我们以HBV DNA阳性的HCC患者为研究对象，进行前?X基因分子流行病学调查. 本实验研究结果表明,在已知基因型的HBV DNA阳性的HCC患者体内普遍表达前?X基因，同时，经过比较，前?X基因在HCC患者中表达率明显高于慢性乙型肝炎患者，具有显著性差异，说明在疾病的不同阶段，其前?X基因表达不相同，提示前?X基因可能与HCC的发生密切相关. 此外，本研究还提示应对慢性乙型肝炎表达前?X的患者进行长期的动态观察，进一步明确前?X基因与HBV所致的疾病不同状态的相关性. 并且我们发现，前?X区主要集中表现在C基因型，但是在B， C混合型中也有较高的表达率，二者并无显著性差异. 由于我们所做的HCC患者中只有1例B基因型，虽未能表达前?X基因，但不能排除样本量的影响. 本试验表明前?X区具有一定的基因型倾向性，但不能肯定是否具备基因型特异性.

　　有研究表明年龄、性别的不同在乙型肝炎演变为肝癌的过程中存在着明显的差异. 但我们发现，年龄、性别的不同在前?X 区的表达组与未表达组均无明显差异. 从乙肝病毒复制指标分析，无论是HBV DNA水平还是HBeAg阳性率，前?X区表达组均高于未表达前?X组的HCC患者，但均无显著性差异. 前?X表达的HCC患者在肝功能损害水平ALT水平、AFP阳性率与未表达的前?X区的HCC患者同样无明显差别. 这些均说明前?X区的表达与性别、年龄等临床相关指标无明显关系，但尚不能排除样本量的关系，仍需进一步观察.

　　我们的研究表明，前?X基因的编码在HCC患者中具有普遍性. 这也就提示在HCC患者体内，可能还存在着一个一直未被研究的蛋白即全X蛋白. 而其与HCC发生、过程的关系也许比HBxAg更为紧密，对其功能及具体机制的研究仍需要我们不断的深入.

【】
  ［1］ Tang H, Oishi N，Kaneko S, et al. Molecular functions and biological roles of hepatitis B virus x protein ［J］. Cancer Sci, 2006,97(10):977-983.

［2］ 董菁，成军. 乙型肝炎病毒前?X基因的初步研究［J］.世界华人消化杂志，2003,11:1097-1101.

［3］ Naito H, Hayashi S, Abe K. Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type?specific primer ［J］. Clin Microbiol, 2001,39(1):362-364.

［4］ 董菁，杨倩，成军. 乙型肝炎病毒基因组前?X区的分子流行病学研究［J］.世界华人消化杂志，2004,12（1）：42-46.

［5］ Takahashi K, Kishimoto S, Ohori K, et al. A unique set of mutations in the “preX” region of hepatitis B virus DNA frequently found in patients but not in asymptomatic carriers: implication for a novel variant［J］. Int Hepatol Commun, 1995, 3:131-138.

［6］ 董菁，成军，杨倩. 乙型肝炎病毒新开发读码框架的确定及其意义［J］. 世界华人消化杂志，2004，12（4）：757-762.

［7］ 薛红安，杨倩，刘拉羊，等. 乙型肝炎病毒全?X基因的克隆及原核表达［J］. 第四军医大学学报，2004，25（23）2133-2135.