药物敏感试验指导小鼠胃癌化疗对凋亡及P53基因的影响

【摘要】  　　目的： 通过应用药敏试验筛选化疗药物对多次传代的荷瘤鼠进行化疗，了解其疗效以及对移植瘤凋亡及P53基因的影响. 方法： 用MTT法检测小鼠胃癌细胞对6种化疗药物的敏感性，对荷瘤鼠进行化疗，观察化疗后移植瘤的体积、抑瘤率，检测凋亡及P53基因的表达. 结果： 用MTT法筛选最敏感的化疗药5?FU对第一代荷瘤小鼠进行化疗，其抑瘤率高，凋亡率高，P53基因的表达下降，与对照组比较有显著性差异；最不敏感的ADM化疗组抑瘤率低，凋亡率低，P53基因的表达高于对照组(P＜0.05). 再对已行化疗的胃癌细胞筛选最敏感药物为DDP，最不敏感药物为用MMC，对第二代荷瘤小鼠进行化疗，发现DDP组抑瘤率高，凋亡率高，P53基因的表达较对照组低(P＜0.05)；MMC组抑瘤率低，凋亡率低, P53蛋白表达高，与对照组比较无显著性差异. 而继用5?FU和ADM化疗对第二代荷瘤小鼠进行化疗，抑瘤率低，凋亡率低，P53基因的表达高，与对照组比较无显著性差异. 结论： 药敏试验、凋亡及P53基因的检测可作为化疗药物的选择及判断预后的指标.

【关键词】  药物敏感试验 胃肿瘤 细胞凋亡 基因 P53

      0引言

    如何选择敏感抗癌药，制定胃癌的个体化方案，是提高胃癌化疗的关键. 我们通过应用小鼠胃癌细胞筛选化疗药物，对多次传代的荷瘤鼠进行化疗，检测化疗后小鼠胃癌组织中P53的表达及凋亡情况，并分析是否与其临床疗效一致，探讨临床化疗药物的选择、对荷瘤鼠胃癌组织中P53的表达和凋亡的影响，以便实施的、药物适配的个体化方案.

    1材料和方法

    1.1材料小鼠胃癌细胞株 MFC TCM23(中科院上海细胞所)；MTT，细胞培养基，胎牛血清，TUNEL，P53试剂盒购自武汉博士德公司. 卡铂(CBP)、顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、5?氟尿嘧啶(5?FU)、甲氨蝶呤(MTX)、丝裂霉素(MMC)均为国产药品. 昆明小鼠(清洁级,购自南方医科大学实验动物中心,珠江动物所饲养),雄性,1月龄,体质量18~22 g.

    1.2方法

    1.2.1胃癌细胞株对化疗药物敏感性取对数生长期细胞制成含活细胞(3~6)×108/L的细胞悬液，在96孔培养板中每孔加入胃癌细胞悬液200 μL，培养贴壁后离心去上清，加入培养液190 μL/孔,加入下列抗肿瘤药物10 μL/孔,即CBP, DDP, ADM, 5?FU, MTX, MMC，每种药物终浓度为血浆峰值浓度，每种药物3个复孔，阴性对照为培养液, 37℃  CO2培养48 h，取出各孔加MTT(5 g/L)20 μL,继续培养4 h,离心弃上清后, 每孔加二甲基亚砜100 μL终止反应.置酶标仪测定各孔在570 nm波长值. 抑制率=［1-用药组A/对照组A］×100%. 根据抑制率筛选敏感、不敏感化疗药物. CBP, DDP, ADM, 5?FU, MTX, MMC的抑制率为41.9%, 47.2%, 26.5%, 49.6%, 31.2%, 30.0%, 5?FU抑制率最高，ADM抑制率最低.

    1.2.2动物模型及分组将 MFC细胞制成含活细胞109/L细胞悬液0.1 mL，接种于小鼠后肢皮下,约7 d在接种部位长出直径1.5 cm左右的移植瘤.

    对照组1： 用胃癌细胞株接种小鼠10只，接种7 d末鼠尾静脉给予生理盐水0.2 mL，共5 d，接种12 d末处死小鼠取瘤块. 实验组1：用胃癌细胞株接种小鼠10只，接种7 d末鼠尾静脉给予5?FU（高敏感药），30 mg/（kg·d），共5 d，化疗5 d末处死小鼠取瘤块. 实验组2：用胃癌细胞株接种小鼠10只，接种7 d末鼠尾静脉给予ADM（低敏感药），0.8 mg/（kg·d），共5 d，化疗5 d末处死小鼠取瘤块. 处死小鼠后瘤块一部分作石蜡包埋，一部分制成单个细胞悬液再接种小鼠，实验组1、实验组2的10只小鼠的一部分单个细胞悬液再行MTT法检测化疗药物敏感性，已用5?FU化疗后的小鼠胃癌细胞对CBP, DDP, ADM, 5?FU, MTX, MMC的抑制率为47.8%, 50.2%, 14.9%, 23.5%, 35.0%, 35.5%,筛选出最敏感的化疗药物为DDP. 已用ADM化疗后的小鼠胃癌细胞对CBP, DDP, ADM, 5?FU, MTX, MMC的抑制率为41.6%, 32.3%, 22.2%, 37.0%, 35.9%, 20.2%，筛选出最不敏感的化疗药物为MMC.

    　对照组2：用对照组1的10只小鼠胃癌细胞再接种小鼠10只，接种7 d末鼠尾静脉给予生理盐水0.2 mL，共5 d，接种12 d末处死小鼠取瘤块. 实验组3： 用实验组1的10只小鼠胃癌细胞再接种小鼠10只，接种7 d末鼠尾静脉给予5?FU，30 mg/（kg·d），共5 d，化疗5 d末处死小鼠取瘤块. 实验组4：用实验组2的10只小鼠胃癌细胞再接种小鼠10只，接种7 d末鼠尾静脉给予ADM，0.8 mg/（kg·d），共5 d，化疗5 d末处死小鼠取瘤块. 实验组5：用实验组1的10只小鼠胃癌细胞再接种小鼠10只，接种7 d末鼠尾静脉给予DDP，1.8 mg/（kg·d），共5 d，化疗5 d末处死小鼠取瘤块. 实验组6：用实验组2的10只小鼠胃癌细胞再接种小鼠10只，接种7 d左右成瘤，接种7 d末鼠尾静脉给予MMC， 0.16 mg/（kg·d），共5 d，化疗5 d末处死小鼠取瘤块.

    处死小鼠后用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），肿瘤体积和肿瘤生长抑瘤率：体积（cm3）=ab2/2. 抑瘤率=［(对照组平均体积-治疗组平均体积)/对照组平均体积］×100%

    1.2.3免疫组化检测P53的表达小鼠处死后取肿瘤组织，制成石蜡切片，观察病理变化，采用免疫组化SABC法，石蜡切片脱蜡至水，30 mL/L H2O2去除内源性酶，加入适当稀释的一抗，4℃过夜；滴加二抗，37℃孵育20 min；DAB显色、苏木精复染，光镜观察结果，200倍下观察5个视野,计算阳性细胞数占总细胞数的百分比. 判断标准：用已知阳性的乳腺癌组织切片作阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照. P53：细胞核出现棕黄色为P53阳性.

    1.2.4TUNEL染色法检测移植瘤凋亡以细胞核阳性为标准，凋亡细胞呈蓝黑色颗粒状或弥漫性，散在或簇状分布于肿瘤组织中，结合HE染色，选择无细胞坏死的5个视野，对TUNEL染色阳性细胞记数，每个视野计数1000个以上细胞，以阳性细胞所占百分率作为凋亡指数（AI），取5个视野AI均值进行统计分析.

    统计学处理： 数据用x±s表示,组间比较采用方差分析及Dunnett?t检验进行统计学分析.

    2结果

    2.1药物对小鼠移植瘤生长的影响实验组1与对照组1肿瘤体积（cm3）相比有统计学差异(0.90+0.12 vs 1.64+0.27， P＜0.05），抑瘤率为45.0%，对小鼠移植瘤有明显的抑制作用. 实验组2（1.39+0.31）与对照组1肿瘤体积相比无统计学差异（P＞0.05），抑瘤率为15.0%. 实验组3, 实验组4, 实验组6与对照组2肿瘤体积（cm3）相比无统计学差异（1.32+0.29 vs 1.56+0.24; 1.35+0.27 vs 1.56+0.24; 1.34+0.16 vs 1.56+0.24, P＞0.05），抑瘤率为15.4%, 13.4%和12.72%. 实验组5（0.87+0.12）与对照组2肿瘤体积相比有统计学差异（P＜0.05），抑瘤率为43.9%.

    2.2药物对P53表达和凋亡率的影响实验组1与对照组1 P53表达阳性率、凋亡率相比有统计学差异（P＜0.05）,实验组2与对照组1 P53表达阳性率、凋亡率相比无统计学差异（P＞0.05，表1，图1，2）实验组3、实验组4、实验组6与对照组2 P53表达阳性率、凋亡率相比无统计学差异（P＞0.05），实验组5与对照组2 P53表达阳性率、凋亡率相比有统计学差异（P＜0.05，表1，图1，2）. 表1小鼠移植瘤P53表达和凋亡率

    3讨论

    许多化疗药可通过诱导肿瘤细胞的凋亡达到肿瘤的目的［1-2］，目前胃癌常用化疗药均能诱导胃癌细胞凋亡［3］. Stathopoulos等［4］根据对细胞凋亡作用的大小筛选出 Paolitaxel和卡铂，联合用于47例晚期胃癌患者的二线化疗，有效16例，病情稳定13例，提高了生活质量并延长了患者的生存期. 通过本实验可以看出，用药敏试验先筛选出小鼠胃癌细胞株敏感的化疗药5?FU，对第一代荷瘤小鼠进行化疗，其抑瘤率高，肿瘤细胞凋亡率高，第一代荷瘤小鼠进行全身化疗后，再对已行全身化疗的胃癌细胞筛选敏感药物，筛选出最敏感的化疗药是顺铂，用顺铂对第二代荷瘤小鼠进行全身化疗，发现顺铂组抑瘤率高，肿瘤细胞凋亡率高. 本实验说明，对胃癌有明确疗效的化疗药的确可诱导肿瘤凋亡，化疗药可能是通过诱导肿瘤凋亡来发挥作用. 药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力，它已成为筛选化疗药的一种新指标，我们下一步可考虑根据对细胞凋亡作用的大小筛选化疗药指导临床用药.

    已证实野生型P53基因可促进细胞凋亡，而突变型P53基因抑制细胞凋亡［5］. 突变的P53基因产物在恶性肿瘤细胞中并与野生型P53蛋白结合，使之丧失作用，肿瘤中的P53蛋白可增至正常的5~10倍［6］. Mugurumak等［7］发现P53表达阴性的患者化疗敏感性高于P53蛋白表达阳性患者，故P53的表达也可作为临床化疗疗效指标.通过我们的实验可以看出，筛选出小鼠胃癌细胞株敏感的化疗药5?FU对第一代荷瘤小鼠进行化疗，其疗效好，抑瘤率高， P53蛋白表达降低，与对照组比较，有显著性差异，而ADM组和对照组比较，无显著性差异，第一代荷瘤小鼠进行全身化疗后，再对已行全身化疗的胃癌细胞筛选敏感药物，筛选出最敏感的化疗药是DDP，用DDP对第二代荷瘤小鼠进行全身化疗，发现DDP组疗效好，抑瘤率高，P53蛋白表达降低，用MMC对第二代荷瘤小鼠进行化疗，发现丝裂霉素组疗效差，抑瘤率低，肿瘤细胞凋亡率低, P53蛋白表达高. 对第二代荷瘤小鼠仍采用5?FU和ADM进行全身化疗，发现5?FU和ADM组均疗效不好，抑瘤率低，P53蛋白表达与对照组比较，无显著性差异. 这说明化疗药诱导小鼠胃癌细胞凋亡可能是通过抑制P53基因表达，这是化疗药诱导小鼠胃癌细胞凋亡的分子机制之一，同时P53的表达也可作为临床化疗疗效指标.

    我们用药敏试验筛选的化疗药物对荷瘤小鼠进行化疗，对凋亡及P53基因表达的研究，为肿瘤治疗和预后判断提供重要的思路和方法，根据对细胞凋亡作用的大小筛选化疗药,通过增加促凋亡基因/抑制抗凋亡基因的表达来增加肿瘤对化疗的敏感性,指导临床用药，达到肿瘤的个体化治疗目的.

【】
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［3］ Kim R, Tanabe K, Inoue H, Toge T. Mechanism(s) of antitumor action in protracted infusion of low dose 5?fluorouracil and cisplatin in gastric carcinoma［J］. Int J Oncol, 2002,20(3):549-555.

［4］Stathopoulos GP, Rigatos SK, Fountzilas G, et al. Paclitaxel and carboplatin in pretreated advanced gastric cancer: A phase II study ［J］.Oncol Rep, 2002,9（1）:89-92.

［5］Shinoura N,Sakurai S,Shibasaki F,et al.Co?transduction of Apaf?1 and caspase?9 highly enhances P53?mediated apoptosis in gliomas［J］. Br J Cancer，2002，86(4):587-595.

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［7］ Muguruma K, Nakata B, Hirakawa K, et al. P53 and bax protein sxpression as predictior of chemotherapeutic effect in gastric carcinomal［J］. Gan To KagakuRyoho, 1998,25(3):400-403.