低分子肝素对大鼠脑局灶性缺血再灌注后Bcl?2，Bax表达的影响及保护作用
【摘要】 目的：观察低分子肝素对大鼠脑缺血再灌注后不同时间点Bcl?2,Bax表达的影响及保护作用. 方法：①选用雄性SD大鼠54只，体质量280～330 g. 应用随机数字表法将大鼠分为3组：假手术组、缺血再灌注组和低分子肝素组，每组18只. ②应用免疫组化方法测定海马CA1区神经元细胞凋亡基因Bcl?2,Bax表达情况. ③采用两样本均数的t检验对两组间数据进行分析. 结果：大鼠54只均进入结果分析，缺血再灌注组大鼠脑缺血再灌注6，12，24 h时Bcl?2蛋白在神经元内表达的阳性细胞数较低分子肝素组同一时间点明显减少，两组比较具有显著的统计学意义（P<0.05）. 缺血再灌注组大鼠脑缺血再灌注6，12，24 h时Bax蛋白表达的阳性细胞数较低分子肝素组同一时间点明显增加，两组比较具有显著的统计学意义（P<0.05）. 结论：脑缺血再灌注损伤随再灌注时间延长而加重，低分子肝素可能通过减少Bax蛋白的表达，上调Bcl?2蛋白表达，从而减轻神经元的损伤及凋亡，起到脑保护作用.
【关键词】 大鼠
0引言
大脑中动脉是缺血性脑血管病的易患部位， 在脑梗死患者中大脑中动脉主干分布区梗死占82.2％［1］，我们通过制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型，观察低分子肝素对大鼠脑缺血再灌注后不同时间点Bcl?2,Bax表达的影响及保护作用.
1材料和方法
1.1材料雄性 SD大鼠54只，清洁级，3～4 mo龄，体质量280～330 g［华北煤炭医学院动物实验中心，许可证号scxk（冀）2005?0001］. 动物饲养环境光照，环境安静，温度适中. 应用随机数字表法将大鼠分为3组：假手术组、缺血再灌注组、低分子肝素组，每组18只. 低分子肝素(速避凝，杭州赛诺菲圣得拉堡民生制药有限公司)；Bcl?2, Bax试剂盒、PV?6001(兔二步法)、DAB 显色剂、PBS试剂盒、APES粘片剂、EDTA修复液（北京中杉金桥生物技术有限公司）；苏木素、伊红、多聚甲醛和无水乙醇（本院病理教研室）；CMIAS?真彩医学图像分析系统(北京航空航天大学研制)；Olympus摄像显微镜(日本)；KPJ?1烤片机(天津)；Leica石蜡切片机(德国)；LY?3型切片机(上海)；微量液体加样器(上海)；数码温控微波炉(天津)；手术操作台(自制)；60℃～100℃水育箱(上海).
1.2方法
1.2.1模型制作采用改良Longa等［2］ 法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型. 造模成功评估标准：①提尾时大鼠左前肢内收屈曲；②爬行时向左侧倾倒或按逆时针方向转圈; ③ 右眼Horner征.
1.2.2分组干预假手术组只游离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉. 缺血再灌注组和低分子肝素组均建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型 . 缺血2 h后分别腹腔注射生理盐水1 mL和皮下注射低分子肝素（200 U/kg，用生理盐水稀释至1 mL），两组均于缺血2.5 h后开始再灌注6，12，24 h，每个时间点取6只进行观察.
1.2.3标本采集与检测将大鼠在各个时间点经腹腔注射100 mL/L水合氯醛（0.003～0.004 mL/g） 再次麻醉，固定四肢及头部，迅速打开胸腔暴露心脏，剥离心包，将灌注针头自左心室插入到升主动脉，固定针头，剪开右心耳，依次灌注生理盐水100 mL，40 g/L多聚甲醛(0.01 mol/L PBS，pH 7.4) 500 mL，待肝脏变白变硬后，将大鼠断头取脑，去除嗅球、脑干、小脑，以视交叉和其后4 mm处两点冠状切片，取脑组织块，置4℃，40 g/L多聚甲醛24 h，常规脱水，包埋制成蜡块. 石蜡切片厚度5 μm，40℃水浴展开，用经粘片剂处理过的载玻片捞片，置于60℃烤箱中烘烤1h，再行HE染色和免疫组织化学染色. 石蜡切片脱蜡至蒸馏水，EDTA微波热修复，维持煮沸10 min，冷却至室温，3 mL/L H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶10 min，用PBS洗3次，每次洗3 min，正常山羊血清封闭内源性抗原20 min，滴加适当稀释（1∶100）的一抗，40℃过夜，PBS洗3次，每次洗3 min，滴加抗兔?HRP多聚体，在37℃放置40 min，DAB显色镜检控制. 应用医学图像分析系统及摄像显微镜记录Bcl?2，Bax阳性细胞数，阳性部位位于细胞质，计数4个不重复高倍视野(×200)中阳性细胞数目， 数值用x±s表示.
1.2.4主要观察指标观察各组不同时间点Bcl?2,Bax阳性细胞数.
统计学处理: 采用SPSS 11.5软件进行统计处理，结果以x±s表示，采用两样本均数的t检验对两组间数据进行分析.
2结果
2.1实验动物数量分析纳入大鼠54只，均进入结果分析，无脱失值.
2.2低分子肝素对大鼠脑缺血再灌注Bcl?2,Bax表达的影响假手术组Bcl?2,Bax中均有微弱表达. 低分子肝素组的缺血侧海马CA1区Bcl?2在神经元内的表达随着再灌注时间的延长逐渐增强，再灌注后6,12,24 h,低分子肝素组的Bcl?2表达量明显增多（图1），与缺血再灌注组比较具有显著的统计学意义(t分别为-5.190,-15.005,-14.116, P<0.05）. 缺血再灌注组的缺血侧海马CA1区Bax在神经元内的表达随着再灌注时间的延长逐渐增强，再灌注后6,12,24 h，缺血再灌注组的Bax表达量明显增多（图2），两组间比较具有显著的统计学意义（t分别为4.298,13.094,18.490, P<0.05,表1）.
图1－图2 略
3讨论
自1972年提出细胞凋亡以来，人们发现许多与凋亡有关的物质，如Caspase家族、Bcl?2家族、P53，PARP等抑制这些物质对缺血后神经细胞起到保护
表1各组大鼠脑缺血再灌注6，12，24 h时Bcl?2,Bax的表达（略）
作用［3］ Bcl?2家族就是其中之一，其有两类：①抑制凋亡的Bcl?2家族有Bcl?1，Bcl?2，Bcl?XL，Bcl?X，这些物质可具有明显的抗神经细胞凋亡作用达到保护神经细胞. ②促进凋亡的Bcl?2家族有Bax，Bak，Bad，cl?xs，Bik等，使用这些物质的拮抗剂也可抗神经细胞凋亡［4］ . Bax是在Bcl?2家族中促进细胞死亡，Bcl?2是在Bcl?2家族中具有抗凋亡活性，在细胞内两种功能的Bcl?2成员的比例决定细胞对死亡的敏感性.
我们通过免疫组织化学方法，检测了Bcl?2和Bax在缺血再灌注损伤后海马神经细胞的表达情况，结果表明假手术组和缺血对侧区均有Bcl?2和Bax的散在微弱表达，推测是由于手术创伤刺激引起. 缺血再灌注组及低分子肝素组，海马CA1区Bcl?2，Bax随着时间的延长在神经细胞内表达逐渐增强，这种趋势与郭云良等［5］的关于脑缺血再灌注后神经细胞凋亡与Bcl?2和Bax的表达时相关系的研究结果一致.
吕传真［6］通过前瞻性多中心随机对照法对856例发病48 h内的上海市8家的急性脑梗死患者进行研究，443例接受低分子肝素+低分子右旋糖酐，413例接受低分子右旋糖酐，结果显示低分子肝素治疗脑梗死一定近期疗效. Quartermain等［7］通过对局灶性脑缺血再灌注大鼠应用LMWH(enoxaparin)进行对比研究显示，应用LMWH治疗后的大鼠脑梗死体积明显缩小. 感觉运动功能改善明显好于未经LMWH治疗者，提示LMWH具有神经保护作用. Stutzmann等［8］通过研究证实LMWH能减轻脑水肿和缩小脑梗死体积，促进运动和认知障碍的恢复，认为LMWH除抗凝作用外，还存在其他药理作用如抑制细胞内钙离子的释放，抗氧化作用，抗炎及神经保护作用.
我们的实验结果表明大鼠右侧MCAO 2.5 h再灌注6，12，24 h缺血侧海马区Bax 的表达显著增加，Bcl?2表达不明显，给予低分子肝素处理后， Bax表达减少，Bcl?2表达增加，说明应用低分子肝素治疗后能抑制Bax的表达，增加Bcl?2表达，改善缺血再灌注损伤，提示低分子肝素可能是通过减少Bax蛋白的表达、上调的Bcl?2表达，从而减轻神经元的损伤及凋亡，起到脑保护的作用.
【】
［1］ Tsuchidate R, He QP, Smith ML, et al. Regional cerebral blood flow during and after 2 hours of middle cerebral artery occlusion in the rat［J］. Cereb Blood Flow Metab, 1997，17(10):1066-1073.
［2］ Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke, 1989,20(1):84-91.
［3］ 贾建平. 2003神经病学新进展［M］.北京:人民卫生出版社, 2003:24-25.
［4］ Schabitz WR，Sommer C，Zoder W，et al. Intravenous brain?derived neurotrophic actor reduces infarct size and counterregulates Bax and Bcl?2 expression after temporary focal cerebral ischemia［J］．Stroke，2000，31（9）：2212-2217.
［5］ 郭云良,高英茂. 脑缺血再灌注后神经元和内皮细胞凋亡与的关系Bcl?2和Bax的表达的时相关系［J］.解剖学报，2002，33(2)：151-155.
［6］ 吕传真. 低分子肝素治疗急性脑梗死的前瞻性多中心随机对照临床研究［J］.临床神经,2003,11(2):175-177.
［7］ Quartermain D, Li YS, Jonas S.The low molecular weight heparin enoxaparin reduces infarct size in a rat model of temporary focal ischemia［J］.Cerebrovasc Dis, 2003,16(4):346-355.
［8］ Stutzmann JM, Mary V, Wahl F, et al.Neuroprotective profile of enoxaparin, a low molecular weight heparin, in in vivo models of cerebral ischemia or traumatic brain injury in rats: A review［J］.CNS Drug Rev, 2002,8(1):1-30.
