凋亡蛋白Daxx与TRAF3相互作用的筛选及相互作用位点的鉴定

                              作者：张翠莉，成海恩，王应雄

【摘要】  目的: 利用酵母双杂交技术在成人肝文库中筛选能与死亡结构域相关蛋白（Daxx）相互作用的蛋白，并用哺乳动物细胞中进行了免疫共沉淀验证，以进一步了解Daxx的功能. 方法: 利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增Daxx全长ORF，构建pDBLeu?Daxx载体. 转化MaV203，检测细胞毒性和自激活作用，确定His基础表达的3AT浓度. 依次转化成人肝cDNA文库. 在营养缺陷型培养基上挑取三阳性克隆. 进行回转实验和免疫共沉淀验证，并利用β?gal分析进行了相互作用结构域的鉴定. 结果: 筛库转化效率达到5.8×106个克隆. 筛选到了一株能与Daxx相互作用的阳性克隆，DNA序列分析和同源检索表明该阳性克隆为肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3）.通过回转及co?IP证实了TRAF3能与Daxx相互作用，β?gal分析发现TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用. 结论: TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用，可能参与了Daxx的调控和功能，为进一步了解Daxx作用的分子机制奠定了基础.

【关键词】  凋亡

　　0引言

　　死亡结构域相关蛋白（death domain?associated protein， Daxx）在核内作为转录调控子发挥促凋亡作用［1 ］；另一方面，在各种凋亡刺激下，Daxx可以从核转移到胞质中，介导肿瘤坏死因子受体(TNFR) 超家族成员促凋亡信号的转导. Daxx和FADD分别是Fas下游的两条截然不同的凋亡通路. Daxx通过活化JNK通路，不依赖于caspase,参与凋亡的活化［2］. 随着大量的研究，Daxx的促凋亡功能受到了挑战. 如Michaelson等［3］发现缺乏Daxx 基因的鼠胚胎发育受损,大量胚胎干细胞系出现凋亡,他提出Daxx基因是胚胎发育所必需的,直接或间接起着防止凋亡的作用. 由于Daxx在凋亡方面矛盾的功能，通过对Daxx和其他蛋白质之间相互作用的研究，来了解Daxx的调控和功能，具有非常重要的意义. 我们利用酵母双杂交技术，以Daxx为诱饵在成人肝cDNA文库中筛选相互作用蛋白，以期为进一步研究Daxx作用机制提供有用的线索.

　　1材料和方法

　　1.1材料酵母双杂交系统ProQuestTM Two Hybrid System (CAT SERIES 10835)、成人肝cDNA文库ProQuestTM pre?made cDNA library (Human Liver)购于Invitrogen 公司. JM109感受态、HepG2细胞为本室保存. pCMV?Myc是Clontech公司产品，pFLAG?CMV?2是Sigma公司产品. 各种生化试剂购于北京百灵克生物科技公司. 引物由北京赛百盛公司合成. 序列测定由北京奥科公司完成.

　　1.2方法

　　1.2.1pDBLeu?Daxx载体的构建利用PCR在成人肝文库中扩增全长的Daxx开放阅读框，Daxx引物序列设计如下，P1:      5′?GCG TCG ACC ATG GCC ACC GCT AAC AGC ATC?3′; P2：5′?TTG CGG CCG CTA ATC AG AGT CTG AGA GCA?3′；PCR 反应的条件: 94℃预变性4 min; 94℃变性45 s, 64℃退火45 s, 72℃延伸2 min, 30个循环, 最后72℃延伸7 min. 将回收的PCR片段利用SalⅠ和Not I酶切，随后与同样酶切好的pDBLeu载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态,经卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，提取转化子质粒进行PCR和酶切鉴定后测定DNA序列.

　　1.2.2诱饵质粒的转化和3AT的确定将所构建好的pDBLeu?Daxx转化到酵母MaV203中，通过对3?氨基?1，2，4?三唑（3?Amino?1,2,4?Triazole，3AT）浓度梯度平板上的生长情况来确定抑制His基础表达的3AT水平，观察有无自激活作用.

　　1.2.3双杂交系统对成人肝CDNA文库的筛选和阳性克隆的鉴定用转化了Daxx的酵母制备感受态，然后转化成人肝CDNA文库质粒，通过对His, Ura和X?gal的分析，对转化的酵母进行筛选. 提取能同时激活三个报告基因的阳性克隆的质粒，转化大肠杆菌JM109感受态,经氨苄抗性筛选，提取猎物质粒.
　　
　　1.2.4三阳性克隆的回转验证和序列分析将候选质粒与Daxx回转酵母MaV203，验证表型. 将回转阳性的质粒送公司测序. 随后利用NCBI上BLAST工具，对测序结果进行分析.

　　1.2.5X?gal定性分析TRAF3和Daxx相互作用位点

　　1.2.5.1TRAF3缺失体的pPC86载体的构建设计候选克隆TRAF3的一系列缺失体引物,利用所设计的引物在HepG2细胞反转录cDNA文库中扩增TRAF3及其缺失体，回收PCR片段，然后进行Sal I和Not I双酶切，连接pPC86，转化大肠杆菌JM109，氨苄抗性筛选. 挑阳性克隆PCR和酶切鉴定，送测序.

　　1.2.5.2TRAF3与Daxx相互作用位点的鉴定将TRAF3及其缺失体与Daxx共转酵母MaV203，挑取菌落到覆盖有无菌Whatman滤纸的YPAD平板上，液氮反复冻融，加入Z buffer/X?gal溶液，30℃， 观察24 h内菌落是否变蓝，以确定相互作用位点.

　　1.2.6TRAF3和Daxx相互作用位点的定量分析将TRAF3缺失体与Daxx共转的单克隆接种于2.5 mL SC?Leu?Trp培养液中，摇床过夜. 将1 ml过夜培养物部分接种于5 mL YPAD培养液中，使A600 nm约为0.5，30℃，摇床直到A600 nm为1.0~1.5. 将细胞培养物分装在1.5 mL EP管中，14 000 g离心30 s,小心去除上清. 每管细胞沉淀用100 μL Buffer 1 重悬，加入直径为0.5 mm的酸洗玻璃珠，使终体积为200 μL. 涡悬1~2 min. 准备空白对照，空白对照组成为100 μL  Buffer 1和900 μL Buffer 2. 每个样品中加入900 μL Buffer2，涡悬使混合充分，开始计时. 观察颜色的变化，出现修黄色到棕红色后，空白对照和阳平管中都加入250 μL 6 mmol/L ZnCl2终止反应，记录颜色消逝的时间，反应时间在24 h范围内变动.

　　1.2.7co?IP验证

　　1.2.7.1Western Blot检测融合蛋白的表达分别以pPC86?TRAF3和pDBLeu?Daxx为模板，构建pFLAG?CMV?2?TRAF3, pFLAG?CMV?2?TRAF3TRAF3和pCMV?Myc?Daxx载体. 将HepG2细胞接种到24孔板中，待生长至80％~90%融合时，利用Invitrogen公司的LipofectamineTM 2000将pFLAG?CMV?2?TRAF3, pFLAG?CMV?2?TRAF3TRAF, pCMV?Myc?Daxx分别转染HepG2细胞. 转染4~6 h为细胞换含血清的培养基，继续孵育36 h后裂解细胞，提取蛋白，具体操作方法见PIERCE公司的哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒说明书. 所提蛋白经SDS?PAGE凝胶电泳后电转到PVDF膜上，分别加入一抗（鼠的FLAG和myc抗体）、二抗（辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG），检测FLAG?TRAF3, FLAG?TRAF3TRAF, myc?Daxx融合蛋白的表达.

　　1.2.7.2免疫共沉淀和Western Blot验证将实验组和对照组质粒共转染HepG2细胞. 两个实验组：pFLAG?CMV?2?TRAF3和pCMV?Myc?Daxx，pFLAG?CMV?2?TRAF3TRAF和pCMV?Myc?Daxx；对照组：pFLAG?CMV?2空载体和pCMV?Myc?Daxx. 转染36 h后提取蛋白. 具体操作方法见PIERCE公司的哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒说明书. 取上清加入0.5 μL兔IgG和10 μL protein A agarose，4℃ 转鼓上2 h，离心取上清，加入myc抗体，4℃转鼓上2 h，加入protein A agarose，4℃过夜. 离心，弃上清，用NET?明胶缓冲液洗涤沉淀（具体操作见分子克隆第二版，免疫沉淀法）. 加入2×蛋白上样缓冲液，99℃，5 min变性. 离心取上清，经SDS?PAGE凝胶电泳后电转到PVDF膜上,加入一抗（鼠FLAG抗体）、二抗（辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG），进行immumobloting检测.

　　2结果

　　2.1成功构建诱饵质粒PCR鉴定见图1. 测序结果表明pDBLeu?Daxx载体构建正确.

　　图1Daxx cDNA PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析图　略

　　2.2文库的筛选和三阳性克隆的鉴定将所构建好的pDBLeu?Daxx转化到酵母MaV203中，其抑制His基础表达的3AT水平为25 mmol/L，未见自激活作用. 顺序转化文库质粒,此次筛库的转化效率为2 ×106，共得到42个三阳性克隆，提取酵母pPC86质粒与pDBLeu?Daxx共转酵母，再次对这些阳性菌进行验证，得到11个候选克隆. 测序结果在NCBI上BLASTN分析表明，其中1个克隆为肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3）TRAF domain，同源性为98％.

　　2.3在酵母双杂交系统中TRAF3通过TRAF结构域与Daxx相互作用由于测序结果得到的只是TRAF3的TRAF结构域，  所以我们设计了一系列TRAF3的缺失体引物，在HepG2反转录cDNA文库中成功扩增TRAF3基因，随后成功构建了TRAF3全长及其缺失体的pPC86重组子. TRAF3结构域见图2. TRAF3缺失体和pPC86的重组子PCR和酶切鉴定正确， 测序结果分析证实成功的构建了TRAF3及其缺失体的重组子. 酶切鉴定见图3. 将TRAF3及其缺失体分别与Daxx共转酵母MaV203， 通过His, Ura, X?gal的分析发现pPC86?TRAF3, pPC86?TRAF3?TRAF, pPC86?TRAF3ΔRZF1能激活3个报告基因， 并且在2 h内可见X?gal显蓝. 由此推测， TRAF3通过其TRAF结构域与Daxx发生相互作用. TRAF3及缺失体与Daxx共转酵母的LacZ表型见图4.

　　2.4定量检测TRAF3缺失体与Daxx之间的相互作用为了证实定性分析中TRAF3通过其TRAF Domain与Daxx之间发生的相互作用， 我们用CPRG
R:环指结构；Z:锌指结构；TRAF?N: TRAF结构域的氨基端；TRAF?C:TRAF结构域的羧基端.

　　图2－图4　略

　　来对β?gal进行定量分析. 把实验结果的数值以阳性对照组为100％，每个实验进行三次独立的重复. 结果表明，TRAF3, TRAF3TRAF, TRAF3ΔRZF1和Daxx之间具有强的相互作用，β?半乳糖苷酶的活性达到46％，48％, 42％. pPC86?TRAF3ΔTRAF?C, pPC86?TRAF3TRAF?N, pPC86?TRAF3ZF4?5TRAF?N与Daxx之间有很弱的相互作用，说明了TRAF3的TRAF 结构域的完整性是TRAF3与Daxx之间相互作用所必须的.
2.5在HepG2细胞中进行免疫共沉淀实验验证TRAF3和Daxx之间的相互作用构建pFLAG?CMV?2?TRAF3和pFLAG?CMV?2?TRAF3TRAF和pCMV?Myc?Daxx进行co?IP鉴定. 所有重组子均PCR和酶切鉴定正确，三种重组子测序结果均正确. PCR鉴定见图5. 转染细胞后, 经Western Blot验证，FLAG?TRAF3, FLAG?TRAF3TRAF, Myc?Daxx在HepG2细胞中表达正确，条带大小Mr分别为64, 32, 120×103. 将对照组和实验组三组质粒分别转染HepG2细胞进行免疫共沉淀实验, 结果表明在与Daxx共转的细胞裂解液中,在Mr 32和64×103处有带FLAG标签的TRAF结构域和TRAF3存在（图6B1，4）.

　　图5－图6　略

　　3讨论

　　Daxx最初是被作为Fas相互作用蛋白而被发现的［4］. Fas的活化诱导Daxx和ASK1之间的相互作用，Daxx抑制ASK1分子内氨基末端和羧基末端的相互作用，激活ASK1,从而活化JNK通路［5］.Daxx的过表达同样也促进了TGF?β所诱导的凋亡［6］，该通路对于调节发育、细胞的生长、分化和凋亡也是一条重要的通路［7］. 在HT1080细胞,过高表达Daxx与PODs结构必需成分?早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein, PML)相互作用介导凋亡. 而在缺乏PML 时, Daxx离开PODs呈散在分布,其促凋亡的能力完全受损［6］. 这表明了DAXX在核内的促凋亡作用. 但在另一方面，大量的研究表明Daxx也是一个抗凋亡的基因. 利用基因敲除技术发现在Daxx-/-鼠胚胎早期的致死性［7］. 在细胞中利用RNAi抑制Daxx的表达可见凋亡的增强［8］，并且细胞对Fas, UV, TNFa等凋亡诱导剂的敏感性增加［9］. 除了在凋亡方面的作用外，Daxx还具有转录共抑制功能［10］，它能抑制几种转录因子的活性，如Pax3［10］, E2F1 ［7］, NF?kB ［7］等. 可是,Daxx与转录因子Pax5 (BSAP,具有转录激活和抑制双重功能)结合导致B细胞转录激活,提示Daxx可能具有转录共活化子的功能［11］.
　　
　　为了进一步了解Daxx的复杂功能，我们利用酵母双杂交系统，在成人肝cDNA文库中筛选到了肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF3的TRAF Domain能与Daxx相互作用. TRAF3蛋白为肿瘤坏死因子受体相关因子（TNF receptor associated factor，TRAF)蛋白家族成员. TRAF与TNF受体(TNFR)超家族成员相关，并介异其信号传导，TRAF3参与CD40的信号传导，CD40为TNFR家庭成员，在免疫应答的激活起重要作用［12］.  TRAF3是淋巴细胞毒素β受体信号复合体的重要组分，淋巴细胞毒素β受体信号复合体诱导了NF?κB的激活以及由淋巴细胞毒素β配体引发的细胞死亡. EB病毒编码的潜伏感染膜蛋白?1(latent infection membrane protein?1，LMP1)能与TRAF3及其它TRAF家族成员相互作用，这种相互作用可能是LMP1致癌作用所必需的. TRAF3由一个ring finger、锌指结构以及TRAF Domain组成.
　　
　　为了验证全长的TRAF3和Daxx在酵母内是否存在相互作用，以及TRAF3与Daxx之间相互作用的位点，我们构建了TRAF3的全长以及包括TRAF Domain在内的一系列缺失体的酵母AD载体与pDBLeu?Daxx共转酵母MaV203,进行了X?gal定性和β?gal定量分析.  结果表明在酵母系统中TRAF3通过其TRAF Domain与Daxx相互作用. 随后我们利用免疫共沉淀技术在HepG2细胞中证实了TRAF3和Daxx之间的相互作用. 该实验表明了TRAF3有可能通过其TRAF Domain参与了Daxx进行调控，从而影响Daxx在凋亡和转录调控中的作用. 为今后进一步对Daxx的功能研究提供了依据.

【】
  　［1］ Pluta AF, Earnshaw WC, Goldberg IG. Interphase?specific association of intrinsic centromere protein CENP?C with hDaxx, a death domain ? binding protein implicated in Fas?mediated cell death［J］. J Cell Sci, 1998, 111(14): 2029-2041.

　　［2］ Khelifi AF, D?Alcontres MS, Salomoni P. Daxx is required for stress?induced cell death and JNK activation［J ］. Cell Death Differ, 2005,12(7):724-733.

　　［3］ Michaelson JS, Bader D, Kuo F, et al. Loss of Daxx, a promiscuously interacting protein, results in extensive apoptosis in early mouse development ［J］. Genes Dev, 1999, 13(15): 1918-1923.

　　［4］ Yang X, Khosravi?Far R, Chang HY, et al. Daxx, a novel Fas ? binding protein that activates JNK and apoptosis［J ］. Cell,1997, 89(7): 1067-1076.

　　［5］ Chang HY, Nishitoh H, Yang X, et al. Activation of apoptosis signal?regulating kinase 1 (ASK1) by the adapter protein Daxx［J］. Science, 1998，281(5384):1860-1863.

　　［6］ Perlman R, Schiemann WP, Brooks MW, et al. TGF?beta?induced apoptosis is mediated by the adapter protein Daxx that facilitates JNK activation ［ J ］. Nat Cell Biol, 2001, 3(8): 708-714.

　　［7］ Siegel PM, Massague J. Cytostatic and apoptotic actions of TGF?beta in homeostasis and cancer ［ J］. Nat Rev Cancer, 2003, (3): 807-821.

　　［8］ Zhong S, Salomoni P, Ronchetti S, et al. Promyelocytic Leukemia Protein (PML) and Daxx participate in a novel nuclear pathway for apoptosis［J］. J Exp Med, 2000, 191(4) :631-640.

　　［9］ Michaelson J S, Bader D, Kuo F, et al. Loss of Daxx, a promiscuously interacting protein, results in extensive apoptosis in early mouse development ［J］. Genes Dev, 1999,13(15), 1918-1923.

　　［10］ Michaelson JS, Leder P. RNAi reveals anti?apoptotic and transcriptionally repressive activities of Daxx ［J］. J Cell Sci, 2003,116(pt 2):345-352.

　　［11］ Kim EJ, Park JS, Um SJ, et al. Identification of Daxx interacting with p73, one of the p53 family, and its regulation of p53 activity by competitive interaction with PML ［J］. Nucleic Acids Res, 2003, 31(18):5356-5367.

　　［12］ Cheng G, Cleary AM, Ye Z, et al. Involvement of CRAF1, a relative of TRAF, in CD40 signaling ［J］. Science, 1995,267(5203): 1494-1498.