17β雌二醇对人桡动脉舒张作用的体外实验

                                     作者：苏海川，赵玉红 ，韦耿泽，陈军，李陕区 

【摘要】  目的： 研究17β雌二醇（17β?estradiol, E2）对人桡动脉(RA)的舒张作用及其机制. 方法： 采用离体血管灌流的方法，观察E2对人RA的舒张作用以及NO合成酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(Nω?nitro?L?arginine methyl ester, L?NAME)，8?Br?cGMP和鸟苷酸环化酶抑制剂美蓝(MB)对这一过程的影响. 结果： 观察到E2(0.1~100 μmol/L)可剂量依赖性地舒张血管且具有内皮依赖性；8?Br?cGMP(0.1~1×103 μmol/L)也可引起剂量依赖性的血管舒张效应. 10 μmol/L MB使E2舒张人RA的作用完全消失. 10 μmol/L L?NAME能部分抑制E2舒张TA的作用. 结论： E2对RA的急性舒张作用具有内皮依赖性. 此作用是E2通过非基因组方式使血管内皮细胞分泌NO、进而可能引起血管平滑肌细胞内的cGMP水平升高实现的.

【关键词】  雌二醇；桡动脉；一氧化氮； 环GMP

　0引言
    
　　绝经前妇女心血管疾病发病率明显低于同龄男性和绝经后妇女，说明雌激素具有很强的心血管保护作用［1］. 动物研究表明，雌激素能够通过非基因组途径快速舒张血管，雌激素的快速舒血管作用可能是雌激素促进了血管内皮细胞释放NO，进而抑制平滑肌细胞的收缩［2］. 有报道，雌激素可以直接抑制血管平滑肌细胞的收缩作用，产生舒血管作用［3］. 然而，雌激素作用于血管的确切机制还未完全清楚，雌激素对人动脉的作用及其机制也少见报道. 我们采用离体灌流人桡动脉环，观察雌激素对保留内皮和去内皮血管的急性舒张作用，并进一步研究这种舒张血管的作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料人桡动脉由西京心血管外科取材自10例行冠状动脉旁路移植术的男性患者，年龄45～65 (55±8)岁. 17β雌二醇、左旋硝基精氨酸甲酯(Nω?nitro?L?arginine methyl ester, L?NAME)、美蓝（MB）、8?Br?cGMP、去甲肾上腺素（NE）（美国Sigma公司）. RM?6280多道智能生理记录及分析处理系统（第四军医大学生物医学工程系）.

　　1.2方法

　　1.2.1主要药物配制17β雌二醇用DMSO配制成10 mmol/L的原液，实验前用Kreb?s 液稀释成工作液. L?NAME,MB用去离子水配成10 mol/L原液，实验时加入Kreb?s 液，工作浓度为10 μmol/L. 8?Br?cGMP直接用Kreb?s 液配成工作液（0.1~1000 μmol/L）. Kreb?s 液成分（mmol/L）：NaCl 118, KCl 4.75, CaCl2 2.54, KH2PO4  1.19, MgSO4  1.19, NaHCO3 25,  葡萄糖10，充以含950 mL/L O2和50mL/L CO2的混合气，用HCl调pH至7.2～7.4.
 
　　1.2.2离体血管环灌流将游离的RA放入到预冷、充以含950 mL/L O2和50 mL/L CO2  Kreb?s 液中，仔细去除血管上的脂肪及结缔组织，将动脉剪成2～3 mm的小段，然后将血管环套在不锈钢小钩上，放入37℃, 充以含950 mL/L O2和50 mL/L CO2的Kreb?s 液中， 并连接在张力传感器上. 给血管环加0.5 g的前负荷，在Kreb?s 液中平衡至少120 min以上，在此过程中，孵育血管环的液体每15 min换1次，并使前负荷维持在0.5 g. 加入10 μmol/L的NE检测标本活性（收缩幅度小于500 mg者弃去），然后冲洗使血管张力恢复到基线. 稳定30 min后重复给予NE，待血管收缩达到稳定值时逐步增加E2的浓度（0.1～100 μmol/L）. 去内皮采用细钢丝插入血管腔中滚动完成. 用10 μmol/L的乙酰胆碱（Ach）对血管环是否有舒张反应作为判断血管内皮是否完整的标准.

　　统计学处理：   血管环的例数n等于提供血管的患者数. 以NE对血管环收缩的最大效应为100%. 制作累积浓度?舒张反应曲线，求出最大舒张反应值（Rmax）和血管最大舒张的半数有效浓度（EC50）. 统计学处理采用组间t检验， P<0.05为差异显著.

　　2结果

　　2.1E2对人桡动脉的作用人桡动脉血管环用1 μmol/L的NE产生张力，待稳定后加入E2 (0.1～100 μmol/L).  数据用1 μmol/L NE预收缩的血管舒张到未加药前的百分数表示. NE使保留内皮或去内皮的HIMA收缩后，E2可引起剂量依赖性的舒张效应，且具有内皮依赖性(图1).

　　图 1E2对人桡动脉舒张的量效关系（略）

　　2.28?Br?cGMP对人桡动脉的作用人桡动脉血管环用1 μmol/L NE产生张力，待稳定后，加入8?Br?cGMP (0.1～1000 μmol/L). 数据用1 μmol/L NE预收缩的血管舒张到未加药前的百分数表示. NE使RA收缩后，8?Br?cGMP可引起剂量依赖性的舒张效应(图2)，8?Br?cGMP的浓度为1000 μmol/L时，Rmax=(90±8)%，EC50=-4.7±0.3(log10mol/L).

　　图28?Br?cGMP对人桡动脉舒张的量效关系（略）

　　2.3L?NAME对E2舒张人桡动脉的影响人乳内动脉血管环用1μmol/L NE产生张力，待稳定后加入E2 (1×10-4～1 μmol/L). 一些血管环在加入E2之前20 min用L?NAME(10 μmol/L)预处理，数据用1 μmol/L NE预收缩的血管舒张到未加药前的百分数表示. L?NAME可以使E2舒张RA的作用完全消失(图3).

　　图3L?NAME和 MB对E2舒张人乳内动脉效应的影响（略）

　　2.4MB对E2舒张人桡动脉的影响人乳内动脉血管环用1 μmol/L NE产生张力，待稳定后加入E2 (1×10-4～1 μmol/L). 一些血管环在加入E2之前20 min用MB (10 μmol/L)预处理，数据用1 μmol/L NE预收缩的血管舒张到未加药前的百分数表示. 10 μmol/L的MB可以使VNP舒张HIMA的作用完全消失.

　　3讨论
 
　　E2的急性舒血管作用为非基因组机制，雌激素受体α和β都可能参与其中，以往报道，其效应呈内皮依赖性和内皮非依赖性，NO在雌激素的舒血管作用中起关键的作用［4-5］. NO分泌后可以激活血管平滑肌细胞中的GC，使细胞内cGMP浓度升高，进一步激活PKG，产生舒血管作用［6］. 这些研究是以动物为研究对象得到的实验结果，而E2对人桡动脉的作用还少见报道. 本实验采用冠状动脉旁路移植术使用的桡动脉来观察E2对其的作用.

　　
　　我们的结果显示：E2对人RA的舒张为内皮依赖性的，而NOS抑制剂L?NAME可以完全抑制E2的舒张作用，说明雌激素的急性舒血管作用依赖于血管内皮分泌的NO. GC抑制剂MB抑制E2对RA的舒张作用程度与L?NAME大致相等，用cGMP类似物8?Br?cGMP同样能够产生强烈的舒血管作用，且与E2的舒血管作用相似，进一步阐明了E2的舒血管作用有赖NO?cGMP通路的参与. 　　NO?cGMP通路激活GC，升高细胞内重要的第二信使cGMP，通过cGMP的介导，激活PKG，PKG通过以下机制产生舒血管作用： ①    抑制L?型钙通道，减少钙内流，增加钙泵对钙的摄取，从而降低细胞内游离的钙离子浓度；② 直接作用于收缩蛋白而使血管舒张；③ 在某些血管组织中，PKG还可特异性抑制磷酸二酯酶活性，阻止cAMP降解而加强cAMP介导的舒张作用；④ 活化K+通道，加速细胞复极化，抑制钙内流［7］. 我们的结果表明L?NAME和MB可以完全阻断E2的舒血管作用，提示E2激活NO?cGMP通路产生舒血管效应［8］. E2的快速舒血管作用为内皮依赖性，说明血管内皮细胞在E2的刺激下分泌NO增加，引起血管舒张. 这与Geary等［9］在小鼠大脑动脉的研究是一致的. Binko的研究发现［10］： 去内皮后的大鼠胸主动脉急性暴露10-6 mol/L的E2 10  min后并没有明显减弱新福林引起的收缩作用，而与E2孵育24 h后，可以明显减弱新福林收缩血管的程度，并活化平滑肌细胞NOS，刺激NO的表达和分泌.
　　
　　总之，E2对TA具有依赖内皮的舒张作用. 它作用于血管内皮细胞促进NO的释放，激活NO?cGMP通路，舒张血管. 这是以非基因组的方式快速舒张TA.

【】
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　　［2］ Cruz MN, Douglas G, Gustafsson JA, et al. Dilatory responses to estrogenic compounds in small femoral arteries of male and female estrogen receptor?beta knockout mice［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006,290(2):H823-829.

　　［3］ Leung HS, Seto SW, Kwan YW, et al. Endothelium?independent relaxation to raloxifene in porcine coronary artery［J］. Eur J Pharmacol， 2006, 20, ［Epub ahead of print.

　　［4］ Nevala R, Paukku K, Korpela R, et al. Calcium?sensitive potassium channel inhibitors antagonize genistein? and daidzein?induced arterial relaxation in vitro［J］. Life Sci, 2001, 69(12):1407-1417.

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