p38丝裂原活化蛋白激酶在大鼠视网膜缺血再灌注损伤后的磷酸化及其意义
【摘要】 目的： 观探讨大鼠视网膜缺血再灌注损伤后p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化及其意义. 方法： 采用升高眼内压的方法，制作实验性视网膜缺血再灌注大鼠模型. 将30只Wistar大鼠随机分为正常组（n=6）和缺血再灌注组（n=24），其中缺血再灌注组又分为再灌注后2，12，24，72 h等4个时间段（每时间段6只）. 应用Western Blot法检测视网膜组织中p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK （p?p38 MAPK）蛋白的表达变化. 结果： p38 MAPK在缺血再灌注组各时间点的视网膜组织内的表达保持相对恒定，与正常对照组相比无统计学上的变化（P>0.05）. p?p38 MAPK的表达水平在缺血再灌注组12 h时即有明显升高，24 h时达到高峰，72 h时仍维持较高的表达水平，与正常对照组相比有统计学著差异（P<0.01）. 结论： p38 MAPK信号通路的激活可能与缺血再灌注所造成的视网膜损伤有密切关系.
【关键词】 视网膜；再灌注损伤；p38丝裂原活化蛋白激酶类；印迹法，蛋白质；大鼠
0引言
视网膜缺血再灌注（retina ischemia?reperfusion injury）损伤主要发生在视网膜动静脉阻塞、未成熟的视网膜病变、糖尿病性视网膜病变等视网膜血管阻塞所致的缺血性疾病中，它们均可造成不同程度的视网膜缺血. 在缺血再通后，视网膜反而受到更为严重的损伤，造成视功能下降［1- 2］. 因此，加强对视网膜缺血再灌注损伤机制的研究是非常重要的. 目前视网膜缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，本实验通过建立大鼠的视网膜缺血再灌注损伤模型，观察丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）家族成员之一的p38 MAPK蛋白在缺血再灌视网膜中的表达以及其磷酸化的时相变化，探索p38 MAPK在视网膜缺血再灌注损伤中的可能作用，为临床视网膜缺血再灌注损伤类疾病提供理论依据.
1材料和方法
1.1材料成年健康Wistar大鼠30只，第四军医大学实验动物中心提供. 雌雄不拘，体质量270～300 g，室温环境饲养. 小鼠抗p38 MAPK及小鼠抗磷酸化p38 MAPK (p?p38 MAPK)单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；山羊抗β?actin多克隆抗体购自美国Chemicon公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或山羊二抗购自Chemicon公司；ECL化学发光试剂盒、PVDF膜购及Hyperfilm胶片自美国Amersham公司；蛋白质提取及浓度测定试剂盒购于美国BioRad公司.
1.2方法
1.2.1视网膜缺血再灌注模型的建立动物随机分成两组：正常对照组（6只）和缺血再灌注组（24只）. 缺血再灌注组又分为再灌注后2, 12, 24, 72 h等4个时间段（每时间段6只大鼠）. 以前房灌注升高眼压的方法制备大鼠视网膜缺血. 再灌注损伤模型，具体方法为： 大鼠以水合氯醛麻醉(400 mg/kg)，将生理盐水瓶连接输液器，升高输液瓶至于大鼠眼垂直距离为150 cm左右处，灌注压力达到110 mm Hg (14.63 kPa). 将连接输液器的7号头皮针自大鼠颞侧角膜缘穿刺入前房，手术显微镜直视下可见灌注压平衡后，视网膜苍白水肿，表明视网膜中央动脉供血已被完全阻断. 60 min后降低液瓶高度至27 cm以下(<20 mm Hg)，此时可见视网膜变红，表明视网膜血管重新开放，已形成再灌注. 此时拔出前房灌注针头，再灌注计时开始.
1.2.2视网膜内p38MAPK和p?p38MAPKA的检测① 视网膜组织蛋白质的提取：正常对照组动物及再灌注后第2, 12, 24, 72 h的动物以水合氯醛麻醉，快速取双侧眼球，分离出视网膜，液氮中速冻. 加入裂解缓冲液（0.15 mol/L NaCl, 0.05 mol/L Tris, 0.1 mg/L SDS，0.1 mg/L苯甲磺酰氟，1 μg/L抑蛋白酶肽，1 mg/L NP?40）. 匀浆，冰上裂解30 min，4℃ 12000 g离心20 min，吸上清，-70℃保存. ② 蛋白质SDS?PAGE及电转印：用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，取20 μg蛋白，进行125 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳结束后，用BioRad半干电转移装置将蛋白质转印至PVDF膜，用含50 mg/L脱脂奶粉的PBST溶液（0.2 mmol/L PBS，0.02 g/L吐温20）封闭，室温2 h. ③ Western Blot检测：分别加入p38 MAPK（1∶2000）， p?p38 MAPK（1∶2500）和β?actin（1∶5000）抗体，室温过夜. PBST洗膜，10 min×3次，再加入HRP结合的羊抗小鼠IgG（1∶5000）或驴抗山羊IgG（1∶5000），室温孵育2 h. PBST洗膜后，加入ECL显色剂，置暗室曝光. 曝光后的胶片进行显影、定影，用UVP凝胶成像系统对胶片上的条带进行扫描分析.
统计学处理：用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测量，测得的p38 MAPK和p?p38 MAPK阳性条带的密度与相应的β?actin条带密度的比值作为其蛋白的相对表达量，采用SPSS10.1分析软件对实验数据进行方差分析以及两两比较的Dunnett?t检验.
2结果
Western blot显示，在正常大鼠视网膜中检测到了p?p38 MAPK, p38MAPK和β?actin蛋白的表达，其中p38 MAPK和β?actin有较高的表达水平，而p?p38 MAPK仅有微弱的表达（图1）. 作为内参照的β?actin在正常海马组织和缺血再灌注后不同时间点的视网膜中的表达水平相当，表明在实验中所加的蛋白量基本一致. p38 MAPK在缺血再灌注组各时间点的视网膜内的表达保持相对恒定，与正常对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）. p?p38 MAPK的表达水平在再灌注后2 h时有轻度增加，但与正常对照组相比无显著差异. 其表达水平在再灌注12 h时明显升高，24 h时达到高峰，72 h时仍维持较高的表达水平，与正常对照组相比有统计学差异（P<0.01），分别是其在正常组海马组织中表达水平的3.9, 5.8和3.4倍（图1, 2）.
图1正常对照组（C）和缺血再灌注后不同时间点大鼠视网膜内p?p38 MAPK，p38 MAPK和β?actin蛋白的表达（略）
bP<0.01 vs正常对照.
图2正常对照组和缺血再灌注后不同时间点大鼠视网膜内p?p38 MAPK和p38 MAPK蛋白的相对表达水平（略）
3讨论
视网膜缺血再灌注损伤是眼科临床很常见的病理生理过程. 由于供应视网膜血液的中央动脉为终末动脉，因此视网膜缺血及循环障碍，会导致视网膜严重损伤. 以往观点认为，恢复血液再灌注是挽救视网膜缺血的重要途径. 但近年的研究表明，视网膜在经历一定时间（60 ~ 90 min）的缺血后其功能并无变化，但是在再灌注后却出现明显的功能障碍，甚至出现不可逆的损伤，这就是视网膜的缺血再灌注损伤. 大量的研究表明，视网膜缺血再灌注损伤的发病机制较为复杂，是多种因素综合作用的结果，如氧自由基的损伤、微血管的损伤、白细胞的作用和钙超载等，但是有关的分子机制尚不清楚［3］.
MAPK在许多生长因子、细胞因子和受体激活早期信号转导事件中起关键作用. 在受到刺激后，MAPK的苏氨酸和酪氨酸残基被磷酸化，激活它们内在的激酶活性，启动一系列的细胞内信号通路. p38 MAPK是MAPK家族的主要成员之一，参与了神经细胞的分化、存活等生理过程. 以往的研究还表明p38 MAPK与包括脑缺血、缺氧等多因素所导致的神经细胞损伤有密切关系［4］，但是p38 MAPK的激活在视网膜缺血再灌注损伤中的作用目前还存在争论. 本实验中，我们观察到缺血再灌注大鼠视网膜内p38 MAPK的表达在各时间点没有变化，但是p?p38 MAPK的表达却在再灌注后12 h明显升高，24 h达到最高水平，72 h时仍然有很高的水平. 上述结果表明在缺血再灌注损伤后，视网膜组织内的p38 MAPK被激活，表现为磷酸化水平增高，提示p38 MAPK的活化在视网膜的缺血再灌注损伤中可能发挥着作用.
研究表明，视网膜在缺血再灌注损伤后，出现萎缩，视网膜细胞明显减少. 视网膜细胞的减少主要是在内五层，这五层主要为神经节细胞层和内核层，其中包含的主要细胞为神经节细胞、双极细胞、无长突细胞和水平细胞［5］. 既往研究报道，p38 MAPK主要表达于视网膜的无长突细胞和节细胞［6］. p38 MAPK的磷酸化在上述两种细胞的增殖和分化过程中具有重要作用. 那么，在视网膜缺血在灌注损伤后，p38 MAPK通路的激活发挥着何种作用，尚不清楚. 有研究提示，p38 MAPK抑制剂SB203580能够有效抑制视神经损伤所导致的视网膜节细胞的凋亡［7］. 还有研究表明，钙通道阻滞剂尼莫地平对缺血再灌注损伤的视网膜具有保护作用，而且该保护作用可通过抑制p38 MAPK mRNA的表达来实现［8］.结合p38 MAPK主要表达的细胞类型，我们推测视网膜缺血再灌注损伤后p38 MAPK通路的激活可能与视网膜的无长突细胞和节细胞的损伤有密切的关系，进一步的研究正在进行中.
【】
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