氟伐他汀对哮喘大鼠气道重建的影响及其机制
【关键词】 氟伐他汀;,支气管哮喘;,气道重建;,癌基因蛋白质p21(ras)
Effect of fluvastatin on airway remodeling in asthmatic rats and its mechanism
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of hydroxymethylglutarylCoA (HMGCoA) reductase inhibitor, fluvastatin, on airway remodeling in asthmatic rats. METHODS: The male SpragueDawly rats were randomly divided into 5 groups with 10 rats in each group: the normal control group (A), the model group (B), the dexamethasone treated group (C), the fluvastatin treated group (D), and the dexamethasone and fluvastatin treated group (E). The asthmatic rat model was established by intraperitoneal injection and repeated inhalation of 10 g/L ovalbumin. The changes of collagen type Ⅲ , proliferation cell nuclear antigen (PCNA) and P21ras contents in the airway wall were detected by immunohistochemistry, and the internal perimeter of bronchi (Pi) and the area of bronchial smooth muscle (WAm) were measured by the computerized image analysis system. RESULTS: ①Fluvastatin inhibitated the proliferation in airway remodeling: The WAm/Pi ［(4.44±0.95) μm2/μm］, the contents of collagen type Ⅲ (32±6) and PCNA (38±10) in group D were lower than those in group B ［(7.01±1.54) μm2/μm, 55±8, 68±12］, the difference being significant (all P<0.05); ②Fluvastatin was less effective in inhibition on the course of airway remodeling than dexamethasone and dexamethasone and fluvastatin combination : The WAm/Pi, the contents of collagen type Ⅲ and PCNA in group D were higher than those in group C ［(3.14±1.06) μm2/μm, 21±6, 26±6］ and group E ［(3.03±0.87) μm2/μm, 20±7, 25±7］ respectively, the difference being significant (all P<0.05). ③The contents of P21ras in group D (24±11) were lower, as compared with group B (57±10, P<0.05). A close correlation was demonstrated between P21ras and PCNA (rs=0.685, P<0.05). The same positive correlation was found between P21ras and collagen type Ⅲ (rs=0.530, P<0.05). CONCLUSION: Fluvastatin could delay the course of airway remodeling in asthmatic rats, which is related partly to the inhibition on P21ras. But the inhibition of fluvastatin on the course of airway remodeling is less effective than the inhibition of dexamethasone.
【Keywords】 fluvastatin; asthma; airway remodeling; oncogene protein p21(ras)
【摘要】 目的：观察羟甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂氟伐他汀对大鼠哮喘模型气道重建的影响. 方法：将50只SD雄性大鼠随机分为5组：空白对照组(A组),哮喘组(B组),地塞米松组(C组),氟伐他汀组(D组)及氟伐他汀与地塞米松合用组(E组).以10 g/L卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏并长期吸入激发制备慢性哮喘模型.用免疫组织化学方法检测各组大鼠肺组织中增殖细胞核抗原（PCNA）,P21ras和Ⅲ型胶原的表达,采用图像分析方法测量气道壁内周长（Pi）及平滑肌面积（WAm）. 结果：①氟伐他汀对气道重建具有抑制作用: D组的WAm/Pi (4.44±0.95) μm2/μm, Ⅲ型胶原和PCNA表达(32±6, 38±10)均低于B组［(7.01±1.54) μm2/μm, 55±8, 68±12］ (P均<0.05); ②D组对气道重建的抑制作用弱于C组和E组:D组的WAm/Pi, Ⅲ型胶原和PCNA表达均高于C组 ［(3.14±1.06) μm2/μm, 21±6, 26±6］和E组 ［(3.03±0.87) μm2/μm, 20±7, 25±7 ］(P均<0.05); ③D组P21ras表达的吸光度值(24±11)明显低于B组(57±10) (P<0.05). P21ras表达与PCNA (rs=0.685, P<0.05)和Ⅲ型胶原(rs=0.530, P<0.05)的表达分别呈正相关. 结论：氟伐他汀可延缓哮喘气道重建的进程,这种作用与P21ras抑制相关,但其抑制增生的作用弱于地塞米松.
【关键词】 氟伐他汀;支气管哮喘;气道重建;癌基因蛋白质p21(ras)
0 引言
由持续性气道炎症而引发的气道重建是支气管哮喘难以的重要病理基础. 氟伐他汀是一种人工合成的羟甲基戊二酰辅酶A(hydroxymethylglutarylCoA, HMGCoA)还原酶抑制剂，已有研究表明其对多种细胞的增殖具有抑制作用［1］，其中包括肺成纤维细胞［2］和气道平滑肌细胞［3］. 这种作用机制可能是通过抑制P2lras(一种由ras基因表达的21KD的膜蛋白)的细胞内定位实现的［1］.本研究采用哮喘大鼠模型,免疫组化方法观察应用氟伐他汀对大鼠肺组织中Ⅲ型胶原沉积, 增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen, PCNA）,P2lras表达,以及对气道壁厚度的影响,并与地塞米松的治疗效果进行比较，旨在了解氟伐他汀对气道重建的抑制作用和这种作用与P2lras之间的相关性.
1 材料和方法
1.1材料
SD大鼠50只,雄性,体质量(180±20) g,购自第四军医大学实验动物中心; 卵白蛋白(ovalbumin, OVA)为美国Sigma公司产品;PCNA,P21ras,Ⅲ型胶原多克隆抗体(兔抗鼠)，链酶素生物素过氧化物酶复合物(SABC), 生物素化的羊抗兔二抗,二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色液均为武汉博士德生物工程有限公司产品;氟伐他汀(商品名：来适可,北京诺华制药有限公司产品)购自第四军医大学西京药剂科,规格为40 mg/粒;HPIAS 1000彩色图像分析系统由第四军医大学西京医院病理科提供.
1.2方法
1.2.1大鼠哮喘模型的制备
按［4］的方法,在实验当日(0 d)和第7日以OVA 10 g/L 2 mL和100 mg氢氧化铝配成的混悬液大鼠腹腔内注射致敏. 第14日开始用10 g/L OVA超声雾化吸入激发,1次/2 d, 30 min/次,共4 wk,以大鼠出现呼吸加快,口唇发绀,腹肌痉挛,点头呼吸及站立不稳等表现时记为激发成功.
1.2.2按不同治疗方法进行动物分组
将50只大鼠随机分为空白对照组(A组),哮喘组(B组),地塞米松组(C组),氟伐他汀组(D组)和氟伐他汀与地塞米松合用组(E组) 5组,每组10只. 各组大鼠致敏激发方法同1.2.1.的方法. A组以生理盐水代替OVA腹腔注射及雾化吸入；B组动物在实验当日(0 d)和第7日以OVA 10 g/L 2 mL和100 mg氢氧化铝配成的混悬液腹腔内注射致敏.第14日开始用OVA 10 g/L超声雾化吸入激发,1次/2 d,30 min/次,共4 wk；C组于第14日开始于每次激发前1 h给予腹腔内注射地塞米松0.5 mg/kg；D组大鼠于第14日开始在致敏前0.5 h用氟伐他汀6 mg/kg灌胃；E组于第14日开始在每次激发前1 h给予腹腔内注射地塞米松0.5 mg/kg和致敏前0.5 h氟伐他汀6 mg/kg灌胃.
1.2.3HE染色及病观察
各组大鼠于最后一次激发后24 h内处死.立即取大鼠肺组织用酒精脱水,石蜡包埋切片,厚度为3 μm,苏木精伊红(HE)染色,光镜下观察模型建立情况和气道重建程度.
1.2.4P21ras,PCNA和Ⅲ型胶原的免疫组化染色
按免疫组化试剂盒说明进行操作：石蜡切片常规脱蜡,酶消化处理,过氧化氢甲醇液灭活内源性过氧化物酶.滴加正常山羊血清封闭液,室温30 min.各组分别滴加1∶200的第一抗体(兔抗鼠P21ras, PCNA和Ⅲ型胶原),4℃过夜.磷酸盐缓冲液(PBS)洗净后,滴加生物素化的羊抗兔IgG,37℃反应20 min,PBS洗净后加链酶素生物素过氧化物酶复合液,37℃ 反应20 min,PBS洗5 min,共4次.滴加DAB显色试剂盒中A,B,C液各1滴,室温显色,镜下控制反应时间(10 min左右),洗净后苏木精复染,树胶封片,一抗以PBS为阴性对照.
1.2.5机图像分析处理
1.2.5.1气道壁厚度测定
光镜下观察HE切片,找到不含软骨且平滑肌成环的完整细支气管,用HPIAS 1000彩色图像分析系统测定支气管管腔的内周长 (internal perimeter of bronchi，Pi)，平滑肌层面积(the area of bronchial smooth muscle， WAm), 用Pi对平滑肌肌层厚度进行标准化,结果以WAm/Pi表示.
1.2.5.2免疫组化半定量测
定光镜下观察各组切片P21ras, PCNA和Ⅲ型胶原阳性表达的差别,每张切片选取3个视野图像,用HPIAS 1000彩色图像分析系统测定各组PCNA,P21ras,Ⅲ型胶原表达含量,依染色深浅程度差别以染色A值表示其相对阳性表达含量［4］.
统计学处理： 数据处理采用SPSS 11.0统计软件, 所有计量资料均以x±s表示. 组间比较采用方差分析, 多重比较采用LSDt检验, 相关性采用Spearman等级相关分析. P<0.05认为有统计学意义.
2 结果
2.1哮喘模型的建立情况
B组大鼠出现致敏后呼吸加快,腹肌痉挛,点头呼吸等情况,病理切片观察存在大量炎细胞的浸润,气道壁增厚,血管和基底膜增生,与A组形成显著对比.A组WAm/Pi为(2.97±0.75) μm2/μm,而B组为(7.01±1.54) μm2/μm,两组相比差异有统计学意义(P<0.05，图1).
2.2氟伐它汀对气道重建的抑制作用
WAm/Pi检测结果D组(4.44±0.95) μm2/μm, 低于B组(7.01±1.54) μm2/μm,差异有统计学意义(P<0.05); D组Ⅲ型胶原和PCNA表达强度(32±6, 38±10)均显著弱于B组(55±8, 68±12)，(P均<0.05).
2.3各组大鼠对气道重建抑制作用的比较
D组WAm/Pi分别高于C组(3.14±1.06) μm2/μm和E组(3.03±0.87) μm2/μm(P<0.05); D组Ⅲ型胶原和PCNA表达强度分别强于C组(21±6,26±6)和E组(20±7,25±7) (P均<0.05). C组与E组比较,在WAm/Pi, Ⅲ型胶原和PCNA表达强度方面均无统计学差异(P均＞0.05).
2.4P21ras表达及其与PCNA,Ⅲ型胶原表达相关性
D组P21ras表达强度(24±11) 低于B组(57±10)和C组(34±6)的表达,差异具有统计学意义(P<0.05) , 但与E组(22±7)比较无明显差异(P>0.05).经Spearman等级相关分析,P21ras表达与PCNA表达呈正相关(rs=0.685, P<0.05), P21ras表达与Ⅲ型胶原表达也呈正相关(rs=0.530, P<0.05).
3 讨论
哮喘反复发作引起气道壁结构的改变即气道重建，由此导致的气流不可逆阻塞和持续的气道高反应性，成为难治性哮喘的病理基础. 本实验结果显示：B组大鼠肺组织平滑肌层增生,大量胶原沉积, PCNA高度表达,而D组大鼠气道平滑肌层增生受到显著抑制,PCNA,Ⅲ型胶原表达下调,提示氟伐他汀可以延缓哮喘大鼠气道重建过程. 赵峰等［2］既往在氟伐他汀对大鼠肺纤维化作用的研究中发现氟伐他汀能减轻博来霉素引起的大鼠肺纤维化.李毅等［3］发现体外不同浓度的氟伐他汀可部分或完全抑制气道平滑肌细胞的增生. 我们发现,在大鼠哮喘模型中, 氟伐他汀不但能够抑制气道平滑肌细胞的增生,也抑制了Ⅲ型胶原的等基质成分的沉积,而这种作用可能是由于气道平滑肌细胞不仅具有收缩功能，而且能表达黏附分子，释放细胞因子和产生基质成分和蛋白酶，而这些物质又能促进ASMC的增殖和加重气道重建［5］.
以氟伐他汀为代表的HMGCoA还原酶抑制剂是一类降血脂药物,近来发现其还具有抑制多种细胞增殖的功能［6-7］. 目前的研究显示, HMGCoA还原酶抑制剂对这些细胞抑制作用均涉及P2lras相关信号通路［1］. 在我们的研究中发现,氟伐他汀应用于哮喘大鼠模型在抑制气道重建细胞增殖的同时,P21ras的表达下降,且下降的程度与PCNA,Ⅲ型胶原表达下降呈正相关,提示氟伐他汀抑制哮喘大鼠气道重建的作用也与P21ras受抑制有关.其可能的机制是:他汀类制剂基本结构的侧链部分与HMGCoA的结构相似,能够竞争性抑制HMGCoA还原酶的作用, 进而抑制P2lras的终止序列CAAX区进行化学修饰的必须基团的合成. 而P2lras作为细胞外信号调节激酶途径和磷脂酰肌醇3激酶途径的交汇点［5］直接影响了ASMC增殖 ［8］.
虽然氟伐他汀能够通过抑制甲羟戊酸代谢途径使P21ras的正常结构异常,功能活性受抑, 但其并不能特异性阻断P21ras表达,因此我们推测其抑制气道重建的效果是有限的,本实验的结果验证了这种推测.在与常规药物地塞米松的比较中，D组在平滑肌层厚度,Ⅲ型胶原和PCNA的吸光度值方面分别高于C组和E组.这一结果提示氟伐他汀虽在一定程度上抑制了P21ras的功能活性,进而抑制了气道重建的过程,但其作为哮喘治疗的药物应用于临床还需要进一步的研究.
【】
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