甲氧滴滴涕对孕鼠生殖及其胎鼠发育的影响

                                             作者：王晓蓉，陈必良，马向东，常飞

【关键词】  甲氧滴滴涕；,生殖毒性；,发育毒性；,生殖激素

　　Reproductive and developmental toxicity of methoxychlor in pregnant mice and their foetuses

　　【Abstract】 AIM:  To explore the effects of  methoxychlor (MXC) on reproduction and development in mice. METHODS: The pregnant mice were administered by oral gavage with MXC at different doses of  0, 20, 100 and 200 mg/kg during day 12-17 of pregnancy. Meanwhile, other pregnant mice as a control group were gavaged sesame oil solvent in the same manner. The changes in body mass and number of corpora lutea of the pregnant mice were observed; and the body mass and anogenital distance (AGD) of their  F1 foetuses were recorded, too. The concentrations of estradiol (E2 ) and progesterone (P) in sera of the pregnant mice were determined using radioimmunoassay. RESULTS: Reproductive toxicity: with the increase of the administered MXC dose, the nidation quantity decreased, the AGD in the male foetuses exhibited shorter than that in the controls, and the concentrations of E2 and P in sera went up. Significant differences in these indexes were found between the MXC treated groups and the control group (P<0.05). Developmental toxicity: with the increase of the administered MXC dose, the gained weights of pregnant mice reduced, the quantity of live fetuses decreased, and the incidence of adverse pregnancy outcome (fetal death, absorption) went up. The difference among the differentdose MXC groups and the control group were significant difference (P<0.05). CONCLUSION: MXC can disrupt reproductive function, thereby resulting in dysgenesis and maldevelopment in mice.

　　【Keywords 】  methoxychlor; reproductive toxicity; developmental toxicity; reproductive hormone

　　【摘要】 目的: 研究甲氧滴滴涕(MXC)染毒对孕小鼠生殖和胎鼠发育的影响. 方法： 将交配成功的雌鼠于孕12～17 d每日给予不同剂量的MXC(0，20，100，200 mg/kg)灌胃,并设芝麻油溶剂为对照组，观察各组孕鼠体质量和黄体等计数测定，同时观察各组F1子代仔鼠的体质量和肛门生殖器距离等，采用放射免疫法检测孕鼠血清雌二醇(E2)和孕酮(P)含量.  结果：生殖影响：随染毒剂量增加，母鼠子宫着床数减少,雄性胎鼠肛殖距（AGD）缩短,孕鼠血清中E2和P水平升高, 呈不同剂量间差异,具有统计学意义(P<0.05). 发育影响：随染毒剂量增加孕鼠体质量增长减少，活胎数下降,不良妊娠结局(死胎、吸收胎数) 增多, 呈不同剂量间差异,具有统计学意义(P<0.05). 结论: MXC可干扰孕小鼠的生殖功能,导致生殖和胎仔发育毒性.

　　【关键词】 甲氧滴滴涕；生殖毒性；发育毒性；生殖激素

　　0　引言

　　环境污染对人类健康的影响一直是界所关注的问题. 甲氧滴滴涕(methoxychlor，MXC)作为一种替代滴滴涕的有机氯杀虫剂，其杀虫效果明显，而生物毒性相对较低，因而在全球范围内得到广泛应用. 但近年来的研究发现，MXC仍然具有诸多方面的毒性作用［1-2］，尤其以生殖毒性引人注目，并发现MXC及其代谢产物在体内外具有雌激素样作用和抗雄激素活性作用［3-4］ ，文建国等［5-6］也报道MXC对雄性生殖系统有一定的损害. 而MXC 对人类胚胎发育效应的研究报道较少. 我们采用MXC染毒并分组观测孕小鼠的各项生理指标，旨在探讨MXC对孕小鼠生殖和胎鼠发育方面的影响.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　成年雄性昆明小鼠12只, 成年雌性昆明小鼠24只,体质量均(28±3) g,由第四军医大学实验动物中心提供,自由采食,饮水,室温20～22℃,昼夜交替为14/10 h. MXC标准品购自美国Sigma公司（纯度：99％，批号：49054）；芝麻油为市售的纯正芝麻油；雌二醇(estradiol， E2 )和孕酮(progesterone，P)放射免疫试剂盒购于北京北免东雅生物研究所；放免γ 计数仪，西安二六二厂生产，型号:2003PS；台式低温高速离心机，德国 kendro 公司，型号：D37520；分析天平，瑞士Mettler Toledo公司生产，型号：AG135.

　　1.2方法

　　1.2.1动物分组及染毒

　　雄鼠与处于动情前期的雌小鼠按1∶2 比例合笼交配, 于次日清晨对雌鼠阴道涂片检查精子,以发现阴栓和查到精子为孕0 d. 并按孕0 d体质量随机分为对照组（芝麻油组）,低剂量组（20 mg/ kg）,中剂量组（100 mg/ kg）和高剂量组（200 mg/ kg）4个组，每组动物均为6 只. 将MXC溶于芝麻油中，参照［7］的方法确定给药剂量，自妊娠第12日起每天灌胃染毒，灌胃量为0.8 mL. 对照组只给相当量的芝麻油. 至妊娠第17日下午（染毒后6 d）称重并处死孕鼠.

　　1.2.2孕鼠生理指标及妊娠结局观察

　　①体质量及增加的体质量变化: 自孕0 d开始直至处死之日，每天称小鼠体质量，并观察记录生长状况. 增加的体质量是指孕12,15和17 d孕小鼠的体质量与孕0 d体质量的差比较. ②黄体数，着床数等计数及妊娠结局：于妊娠第17 d剖腹统计胚胎着床数并在解剖镜下检测双侧卵巢黄体数目，记录活胎、死胎、吸收胎数及内脏外观畸形数，结果进行统计学处理.

　　1.2.3出生后各组F1子代生理及生殖指标检测记录

　　每窝胎仔数，并测量每窝胎鼠的体质量、身长、尾长、肛殖距（肛门与生殖器之间的距离）及性别比. 肛门与生殖器间距离（anogenital distance, AGD）目前已广泛用于评价男性化/男性体征消失指标的检测标准［8］.

　　1.2.4激素放免测定

　　将各组小鼠眼球摘除取血，37℃分离，收获血清，-20℃保存. 使用FJ2003PS放免γ计数仪测定血清E2和P，测定方法按放射免疫试剂盒说明书进行， 结果分别以pg/mL 和ng/mL单位表示.
 　
　　统计学处理: 采用SPSS 13.0软件进行数据处理, 计量资料进行单因素方差分析，多重比较采用SNKq检验法分析, 计数资料用χ2检验分析，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2　结果

　　2.1各组孕小鼠体质量改变比较

　　各组小鼠孕0 d和孕12 d(MXC染毒前1 d)体质量及增长的体质量差异均无统计学意义（P>0.05）. 至孕15 d(染毒完成第3日),高剂量组的体质量和增长的体质量均显著低于对照组(P<0.05). 至孕17 d(动物被处死之日),中剂量组、高剂量组体质量和增长的体质量均显著低于对照组(P<0.05，表1).表1染毒孕小鼠体质量改变比较(略)

　　2.2各组卵巢中黄体、子宫着床、胎盘质量、妊娠结局计数比较

　　卵巢中的黄体计数、着床数及活胎数随着染毒剂量的增加呈递减趋势，高剂量组黄体记数显著低于对照组(P<0.01). 中剂量组、高剂量组的子宫着床数及活胎数均显著少于对照组(P<0.01). 高剂量组的胎盘质量显著低于其他三组(P<0.05). 死胎和吸收胎数情况随染毒剂量的增加而有不同程度的增加，但均无统计学意义(P>0.05). 各组的胎鼠均未发现明显的外观及骨骼畸形(表2).表2各组黄体计数、子宫着床、活胎及异常胎数和胎盘质量比较(略)

　　2.3甲氧滴滴涕对F1子代胎鼠的影响

　　结果显示，中剂量组的胎鼠体质量显著低于对照组,高剂量组的胎鼠体质量均显著低于其他三组(P<0.05),MXC中剂量组、高剂量组雄性胎鼠肛门与AGD明显短于对照组，具有统计学意义(P<0.01），提示与染毒剂量有关. 但无论高剂量还是低剂量组,胎鼠性别保持均衡，仔鼠身长、尾长在各组间亦未出现明显区别(P>0.05,表3).表3甲氧滴滴涕对F1代胎仔的影响(略)

　　2.4各组孕鼠血清中雌二醇和孕酮含量比较

　　孕鼠血清中E2和P含量均随受试物剂量的提高而增高, 对照组和低、 中、 高剂量组孕鼠血清E2的含量测定结果分别为（21.65 ±1.61）, （22.10±4.20）, （24.78±5.26）和（29.00±2.71）pg/mL，而高剂量组孕鼠血清中E2含量明显高于对照组(P<0.05). 对照组和低、中、高剂量组孕鼠血清P的含量测定结果分别为(5.48±1.90), (7.10±1.27), (7.50±1.29)和(11.38±2.84) ng/mL，而高剂量组孕鼠血清P含量均显著高于其他三组(P<0.05).

　　3　讨论

　　有机氯农药作为持久性有机污染物已被定义为环境内分泌干扰化合物,有关MXC对生殖方面的影响正逐渐受到人们重视. 我们采用昆明小鼠作为供试动物，建立了简便、有效的妊娠晚期毒性评价系统，通过对MXC染毒孕鼠生理指标的观察，进一步研究MXC的生殖毒性和胚胎发育毒性.

　　我们的实验结果表明，与对照组相比，MXC中、高剂量组明显缩短新生雄鼠AGD，同时MXC染毒孕鼠卵巢中黄体记数，着床数与对照组相比也明显减少，而孕鼠血清中E2和P含量增高，存在一定的剂量效应关系. 说明MXC可以干扰孕鼠的生殖功能，提示我们MXC及其代谢产物可能与体内雌激素受体结合，发挥雌激素样作用，MXC的生殖毒性与其改变小鼠体内激素水平密切相关.

　　本实验观测孕鼠晚期体内暴露MXC的长期效应. 体质量等指标是子代发育的测量标准［8］，我们在研究中发现，MXC染毒孕鼠体质量增长减少，活胎数下降，而死胎，吸收胎等不良妊娠结局增加，这提示发育中的胚胎和胎儿是MXC作用的敏感靶器官，易受环境污染物MXC影响，MXC具有胚胎发育毒性. 与对照组比较，MXC处理组也阻滞和影响两性子代的发育和体质量. 低、中、高剂量组和对照组胎鼠中均没有发现明显的外观及骨骼畸形，这与染毒剂量和染毒时间有一定关系. 有研究表明MXC毒性作用可能与MXC 诱导一些特异的ER应答和激活MAPK信号转导途径有关，有关MXC造成孕鼠生殖健康危害及胚胎和胎儿毒性作用的具体机制还有待进一步的深入研究.

　　【】

　　［1］Grow WA. The pesticide methoxychlor disrupts the fusion of myoblasts into myotubes in skeletal muscle cell culture ［J］.  Toxicol Appl Pharmacol, 2002,179(2):105-110.

　　［2］Schonfelder G，Wittfoht W，Hopp H，et al. Parent bisphenol A accumulation in the human maternalfetalplacental unit ［J］.  Environ Health Perspect，2002，110(11)：A703- A707.

　　［3］Longnecker P, Klebanoff MA, Zhou HB, et al. Association between maternal serum concentration of the DDT metabolite DDE and preterm and small for gestation age babies at birth［J］. Lancet, 2001, 358(9276):110-114.

　　［4］Gangadharan B, Murugan MA, Mathur PP. Effect of methoxychlor on antioxidant system of goat epididymal sperm in vitro［J］. Asian J Androl, 2001,3(4):285-288.

　　［5］文建国，赵国军，唐国华，等.甲氧滴滴涕对雄性小鼠生殖细胞周期的影响 ［J］. 医学临床研究, 2004, 21(12):1348-1351.

　　［6］唐国华，唐朝克，贺修胜，等.甲氧滴滴涕对雄性大鼠生殖细胞毒性的影响 ［J ］.毒杂志, 2005, 19(4):275-277.

　　［7］Palanza P, Parmigiani S, vom Saal FS. Effects of prenatal exposure to low doses of diethylstilbestrol, o,p′DDT, and methoxychlor on postnatal growth and neurobehavioral development in male and female mice［J］. Horm Behav, 2001，40:252-265.

　　［8］Amstislavsky SY, Kizilova EA, Golubitsa AN, et al. Preimplantation exposures of murine embryos to estradiol or methoxychlor change postnatal development ［J］. Reprod Toxicol, 2004, 18(1): 103-108.