蛋白酶体抑制剂MG
作者：李强，罗卓荆，朱锦宇，毕龙，吕荣，孟浩，耿丹
【关键词】 蛋白酶体抑制剂；,泛素；,肌萎缩；,失神经
Preventive and therapeutic effects of proteasome inhibitor MG132 on denervated muscle atrophy of rats
【Abstract】 AIM: To investigate the preventive and therapeutic effects of proteasome inhibitor MG132 on the denervated muscle atrophy of rats. METHODS: Thirtysix SD were randomly divided into 3 groups, group A: 50 μL MG132 group; group B: 100 μL MG132 group; group C: control group, 12 rats in each group. Standard model of denervated gastrocnemius muscle was established in right limb of each rat. 50 and 100 μL MG132 (concentration 20 μmol/L), 100 μL PBS were respectively given by intramuscular injection once per day to right gastrocnemius muscle of each rat of group A, B and C. Six rats of the each group were separately sacrificed after the last injection of the 1st and 4th week, and the gastrocnemius was harvested for measurement of atrophy rate of muscle, total proteins of muscle, diameter and cross section area of myocyte. RESULTS: At the 1st week postinjectively, atrophy rate of muscle, total proteins of muscle, diameter and cross section area of myocyte in group A and B were （24.5±3.5）% and （18.2±3.3）%, （9.98±0.68） mg/mL and （10.56±0.84） mg/mL, （14.61±1.26） μm and （14.96±1.34） μm, （790.25±12.26） μm2 and （800.28±18.98） μm2; there were significant differences from group C （P<0.05）, and also between group A and B in atrophy rate of muscle （P<0.05）. At the 4th week postinjectively, the above indexes were （60.2±3.7）% and（52.1±4.0）%, （7.04±0.70） mg/mL and （7.96±0.68） mg/mL, （10.63±1.04） μm and （12.16±0.98） μm, （470.48±11.14） μm2 and （498.47±10.34） μm2; there were statistic differences from group C （P<0.05）, and also between group A and B in the above indexes （P<0.05）. CONCLUSION: Denervated muscle atrophy can be partly prevented by proteasome inhibitor MG132 in rats, and the effects rely on the dose of MG132 and the injection duration.
【Keywords】 proteasome inhibitor；ubiquitin；muscle atrophy；denervation
【摘要】 目的：探讨蛋白酶体抑制剂MG132对大鼠失神经肌肉萎缩的防治作用. 方法：36只SD大鼠随机分为3组，每组12只. A组：50 μL MG132组；B组：100 μL MG132组；C组：对照组. 制作成标准的右侧坐骨神经离断，腓肠肌失神经支配模型. 分别在A组和B组大鼠失神经腓肠肌局部注射浓度为20 μmol/L的蛋白酶体抑制剂MG132 50 μL和100 μL，1次/d；C组于相同部位注射100 μL PBS，1次/d. 连续注射1 wk后半数处死各组动物，各组剩余动物连续注射4 wk后处死，取双侧腓肠肌进行肌肉湿重萎缩率、总蛋白含量、肌细胞直径和横截面积测定，并进行统计学分析. 结果： A组和B组肌肉湿重萎缩率、总蛋白含量、肌细胞直径和横截面积注射1 wk时分别为（24.5±3.5）%和（18.2±3.3）%，（9.98±0.68） mg/mL和（10.56±0.84） mg/mL，（14.61±1.26） μm和（14.96±1.34） μm，（790.25±12.26） μm2和（800.28±18.98） μm2， 与C组相比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；肌肉湿重萎缩率A组和B组差异具有统计学意义（P<0.05）. 注射4 wk时分别为（60.2±3.7）%和（52.1±4.0）%，（7.04±0.70） mg/mL和（7.96±0.68） mg/mL，（10.63±1.04） μm 和（12.16±0.98） μm，（470.48±11.14） μm2和（498.47±10.34） μm2，与C组相比较差别均具有统计学意义（P<0.05）. 肌肉湿重萎缩率A组和B组差异具有统计学意义（P<0.05）. 结论：蛋白酶体抑制剂MG132可以通过抑制肌肉降解的泛素蛋白酶体途径延缓大鼠失神经肌肉萎缩，并且随时间的延长其作用具有剂量依赖性.
【关键词】 蛋白酶体抑制剂；泛素；肌萎缩；失神经
0 引言
泛素蛋白酶体通路是失神经骨骼肌分解代谢的主要途径，其对蛋白底物的水解作用，可以被蛋白酶体抑制剂所阻断，从而影响细胞的生理功能［1］. MG132是蛋白酶体抑制剂的一种，属于醛基肽类［2］，目前对MG132的研究主要集中于其抗肿瘤和炎症的作用与机理方面，而对其抑制失神经肌肉萎缩过程中泛素蛋白酶体途径相关的研究报道较少. 本实验中我们制造大鼠失神经肌肉萎缩模型后，在大鼠萎缩肌肉局部注射不同剂量的蛋白酶体抑制剂MG132，旨在观察其对大鼠失神经肌肉萎缩的防治作用.
1 材料和方法
1.1材料
36只SD大鼠，雄性，体质量190～210 g（由第四军医大学实验动物中心提供）；蛋白酶体抑制剂MG132冻干粉(美国Alexix公司)；二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO） (医学院生物医学工程研究所，产品编号D5879）；磷酸缓冲液（PBS），（博士德生物工程有限公司）；Leica图像采集系统（德国Leica公司）；Mias图像分析系统， Libror Age120测量仪（日本DHIMADZU公司）；U2001紫外分光光度计（HITACHI公司）.
1.2方法
1.2.1动物分组及建模
将大鼠随机分成３组: 50 μL MG132组（A组），100 μL MG132组（B组）和对照组（C组），每组12只. 按照［3］的方法制成右侧坐骨神经离断，腓肠肌失神经支配模型.
1.2.2给药方法
蛋白酶体抑制剂MG132溶于DMSO，用PBS稀释至20 μmol/L. 确定失神经腓肠肌的位置，用微量注射器正对肌腹中央刺入皮肤，通过改变针头方向分5个点行肌肉内注射. 按照文献［4］的给药剂量, 局部多点注射MG132：A组50 μL，1/d，B组100 μL，1/d；C组局部多点注射PBS 100 μL，1/d. 连续注射1 wk后半数处死各组动物，各组剩余动物连续注射4 wk后处死，取双侧腓肠肌进行观察.
1.2.3骨骼肌湿重测定
将双侧腓肠肌自股骨内外髁起点至跟骨结节止点完整取下，用Libror Age120测量仪准确称取肌肉湿重，右侧（失神经支配侧）较左侧（神经支配完好侧）腓肠肌的萎缩率.
1.2.4肌肉总蛋白含量的测定
实验侧腓肠肌标本用4 ℃生理盐水冲洗干净，滤纸拭干，剪除表面的筋膜，取0.2 g肌肉组织，加入1 mL细胞裂解液，在冰浴下匀浆，4℃下，2000 r/ min，离心10 min，取上清用Lowry法测总蛋白含量.
1.2.5骨骼肌细胞直径和横截面积的测定
截取称量后的实验侧腓肠肌标本的中段，用40 g/L的甲醛液固定，经脱水处理后，石蜡包埋切片(横切)，厚度为8 μm，行HE染色．使用Leica图像采集系统进行图像采集，使用Mias图像分析系统对同一标本的5个不同视野进行观察，并测量肌细胞直径、截面积，平均值.
统计学处理：数据用x±s表示，用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析，检验水准为α＝0.05.
2 结果
2.1形态学表现光镜下观察结果显示C组大鼠腓肠肌肌细胞核增多，细胞核分布于外周，细胞排列紊乱，细胞直径变小；A组和B组，肌纤维排列改善，有一定的方向性，肌细胞直径大于对照组（图1）.
2.2腓肠肌湿重萎缩率和肌肉总蛋白含量注射1，4 wk时， A组和B组腓肠肌湿重萎缩率和总蛋白含量与C组相比差异均有统计学意义（P<0.05）；1 wk时A组和B组腓肠肌湿重萎缩率之间差异有统计学意义（P<0.05），总蛋白含量之间差异无统计学意义（P>0.05）. 注射4 wk时， A组和B组腓肠肌湿重萎缩率、 总蛋白含量之间差异有统计学意义（P<0.05， 表1）.表1各组大鼠腓肠肌萎缩率和总蛋白含量（略）
2.3腓肠肌细胞直径和截面积注射1 wk时，A组和B组肌细胞直径和截面积较C组差异有统计学意义（P＜0.05），A组和B组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；注射4 wk时，A组和B组肌细胞直径和截面积较C组差异有统计学意义（P＜0.05），A组和B组之间差异有统计学意义（P＜0.05，表2）.表2腓肠肌肌细胞直径及截面积（略）
3 讨论
肌肉失神经后，从组织形态学、细胞学、分子生物学等方面发生了一系列的变化，但其萎缩的病理机制尚未完全明了. 许多学者针对肌萎缩过程中的可能机制，采用感觉神经植入技术、电刺激疗法、神经生长因子转染的基因疗法、氨哮素抑制凋亡、传统的中医中药方法等［5］，但疗效均不满意. 由于失神经后肌肉萎缩的机制十分复杂，针对某种单一机制的治疗，均难以达到理想的效果.
有研究发现在肌肉萎缩过程中，泛素蛋白酶体途径起着极其重要的作用，应用抑制剂抑制该途径，可以作为防治失神经肌肉萎缩的一种新疗法［6］. MG132和其他类型的蛋白酶体抑制剂相比较，其作用强，应用广泛. 体外实验表明，蛋白酶体抑制剂MG132可以抑制失神经所致的鼠骨骼肌蛋白高分解代谢［7］， 本实验中，我们通过体内实验发现：蛋白酶体抑制剂MG132可以延缓失神经损伤后肌肉萎缩，并且随时间延长，延缓作用有剂量依赖性，疗效与体外实验和临床使用的电刺激法［8］相仿. 蛋白酶体抑制剂MG132是一种可逆型抑制剂，当神经长入萎缩肌肉后，其抑制作用可以被清除，恢复肌肉自身正常的代谢，避免了在体内长期蓄积产生的副作用. 本实验中制作坐骨神经离断模型，排除了蛋白酶体抑制剂通过作用于外周神经而延缓肌肉萎缩的潜在可能性.
在抑制降解率方面，体内实验明显低于体外实验，其可能的原因是：①肌肉蛋白组成成分存在差异，在不同的肌肉中，各种蛋白可能由蛋白酶体不同活性位点降解，而MG132主要是抑制了糜凝乳蛋白酶活性位点；②各降解过程可能存在协同作用，各过程并不是单独孤立的存在. 蛋白酶体抑制剂MG132是从肌肉分解代谢的最终途径防治失神经后肌萎缩，在目前没有一种防治方法能够完全控制肌萎缩的情况下，是否可以将其与其他防治方法联合应用，提高神经长入后肌肉功能的恢复，还有待进一步的探讨.
【】
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