端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸对甲状腺癌细胞凋亡的影响

                                            作者：石梅，易军,凌瑞，宫卫东，付莉

【关键词】  甲状腺肿瘤；,寡核苷酸类,,反义；,端粒酶逆转录酶

　　Effect of antisense oligonucleotides encoding telomerase reverse transcriptase on thyroid carcinoma cell apoptosis

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of antisense oligonucleotides (ASODN) encoding telomerase reverse transcriptase (TERT) mRNA on thyroid carcinoma (TC) cell apoptosis. METHODS: The ASODN and sense oligonucleotides (SODN) encoding TERT were delivered respectively to the TC cells in vitro. The effect of ASODN encoding TERT mRNA on TC cell apoptosis was detected by transmission electron microscope, Hoechest 33258 staining and flow cytometry. RESULTS: Transmission electron microscope showed ASODN could induce typical apoptotic manifestations of TC cells; Hoechest 33258 staining showed ASODN could increase the number of apoptotic cells from 52±16 to 178±32; flow cytometry revealed that the apoptosis rates of TC cells treated by 5 μmol/L ASODN, SODN, or nothing were 10.4%, 1.6% and 0, respectively （P<0.05）. CONCLUSION: ASODN complementary to TERT mRNA at some concentration can sequencespecifically enhance TC cell apoptosis.

　　【Keywords】 thyroid neoplasms; oligonucleotides, antisense;　telomerase reverse transcriptase

　　【摘要】 目的：探讨端粒酶逆转录酶(TERT)的反义寡核苷酸(ASODN)对甲状腺癌(TC)细胞凋亡的影响. 方法：体外培养TC细胞，TERT ASODN和正义寡核苷酸(SODN)分别作用于体外培养的TC细胞,采用透射电镜，Hoechest荧光染色，流式细胞仪等方法分析ASODN TERT对TC细胞凋亡的影响. 结果：透射电镜示ASODN可诱导TC出现典型的细胞凋亡形态，Hoechest荧光染色显示ASODN可使TC凋亡数目增多从52±16上升到178±32，流式细胞仪证实5 μmol/L ASODN处理组, SODN处理组及空白对照组的细胞凋亡率分别为10.4%, 1.6%和无凋亡（P<0.05）. 结论： TERT ASODN能增强TC细胞凋亡.

　　【关键词】 甲状腺肿瘤；寡核苷酸类，反义；端粒酶逆转录酶

　　0　引言

　　端粒酶逆转录酶（telomerase　reverse transcriptase, TERT）作为端粒酶蛋白主要组分，被称为端粒酶活性作用的限速因子［1］. 端粒酶通常在除永生细胞系外的正常组织无活性表达，而TERT则可在正常组织中表达［2］. 研究表明，甲状腺肿瘤作为最常见的内分泌肿瘤，其组织端粒酶阳性表达率20％～100％，与癌细胞分化程度有关，分化程度较好的乳头状癌阳性率相对较低(20％～67％)［3-7］，分化较差的滤泡状癌(67％～100％)与未分化癌(67％～100％)比较则较高［5］. 鉴于TERT在甲状腺癌(thyroid carcinoma, TC)中的重要作用,我们采用反义核酸技术,通过封闭TERT基因表达而抑制TC细胞增殖,旨在为防治TC探索基因治疗的新途径.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　手术选取人TC组织,立置pH 7.4 的Hanks液中彻底清洗，并剪成1 mm3左右小块，继续清洗至悬浮液澄清，500 r/min离心5 min，弃上清. 将处理后的甲状腺组织块置三角烧杯中，加入10倍体积的0.5 nkat/L的胶原酶，置50 mL/L CO2孵箱中37℃消化2～3 h，用200目不锈钢纱网过滤于离心管中，500 r/min离心5 min，沉淀即为TC细胞. 加入含200 mL/L新生牛血清的改良Eagle培养液(Dubleccos modified Eagle medium, DMEM),吹打制成细胞悬液;最后以细胞密度5×107/L接种于培养瓶中,置37℃,饱和湿度,50 mL/L CO2的培养箱中培养和传代. 采用与以TERT mRNA翻译启始密码子为起点的一段序列，与该序列互补的为反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASODN)，与该序列相同的为正义寡核苷酸(sense oligonucleotides, SODN). ASODN序列为: 5′GAG CGC GGG TCA TTG TGC T3′;  SODN序列为:5′AGC ACA ATG ACC CGC GCT C3′. 由上海百沃斯生物公司采用DNA生物合成仪合成,全硫代修饰,聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后冻干粉保存. 临用前再加入DMEM液,稀释成5 μmol/L使用.

　　1.2方法

　　1.2.1透射电镜观察

　　ASODN处理组，SODN处理组和空白对照组细胞经2.5 mg/L胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤细胞团2次，40  mL/L戊二醛固定，四氧化锇后固定，梯度乙醇脱水，常规包埋制成超薄切片，染色，观察细胞内超微结构变化.

　　1.2.2凋亡细胞的Hoechst染色

　　取普通洁净盖玻片于700 mL/L乙醇中浸泡5 min或更长时间，无菌超净台内吹干. 将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%～80%满. ASODN处理组、SODN处理组和空白对照组依次加入反义TERT寡核苷酸5 μmol/L,正义TERT寡核苷酸5 μmol/L和RPMI 1640. 置37℃的50 mL/L CO2孵箱中，继续培养44 h后吸尽培养液，加入固定液0.5 mL，固定10 min或更长（可4℃过夜）. 去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，吸尽液体. 加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，染色5 min. 滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片. 荧光显微镜可检测到呈绿色的细胞核. 每张切片在高倍镜下（10×20）观察，随机采集5个不重复视野，输入机图像采集与分析系统，由主PC机进行图像分析处理，检测阳性细胞数目(0.0627 mm2).

　　1.2.3流式细胞仪(FCM)检测

　　各处理组细胞离心，PBS洗涤2次，750 mL/L乙醇悬浮固定后，加入RNase 200 μL (1 g/L)作用30 min，再加入80 μL 碘化丙啶（50 mg/L)染色液4℃，避光染色30 min，上机检测DNA含量及细胞周期，以正常人淋巴细胞的二倍体染色体作内对照，二倍体峰之前亚二倍体峰为凋亡峰.

　　统计学处理： 用SPSS 11.0软件行方差分析两两比较.

　　2　结果

　　2.1透射电镜观察

　　常规培养的TC细胞呈圆形，核大深染，有较多微绒毛，5 μmol/L ASODN处理组可见典型的细胞凋亡形态：较多胞膜突起，微绒毛减少，胞质内细胞器聚集，胞核固缩，染色质致密、边集等早期凋亡的特征性改变，核碎裂形成胞膜包饶的小体即凋亡小体（图1）.A: 常规培养;  B: 5 μmol/L ASODN处理组.

　　2.2Hoechst染色后处理组细胞形态

　　正常TC细胞经Hoechst染色后，细胞核可显色为淡绿色. 凋亡的TC细胞染色质会固缩，细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染（图2）. 经显微镜下凋亡细胞计数结果显示，ASODN处理组凋亡细胞数［（178±32)/mm2］明显高于空白对照组［（52±16)/mm2］，提示ASODN可能通过抑制TERT表达引起正常细胞凋亡. SODN处理组凋亡细胞数［（62±19)/mm2］显示其对细胞凋亡无明显作用.

　　2.3FCM测定DNA含量及细胞周期

　　各处理组细胞的细胞周期分析表明：ASODN能显著降低S期细胞的百分率，G1期细胞百分率增多，在G0/G1期前有一群DNA含量低的细胞形成的峰（凋亡峰）. 6 μmol/L ASODN处理组,SODN处理组及空白对照组的细胞凋亡率分别为10.4%，1.6%及0，处理组与对照组比较有显著性差异（P<0.05）.

　　3　讨论

　甲状腺肿瘤是最常见的内分泌肿瘤. 研究发现端粒酶阳性组TRF较阴性组明显缩短，Ki67表达增加，说明端粒的短缩和端粒酶的活化不仅在TC致病过程中为关键步骤，而且与肿瘤细胞增殖有关［8］. 通过控制TC细胞增生相关基因表达而抑制其反应性增生过程,有望防治TC. 端粒酶是一种RNA依赖性的DNA聚合酶，主要由端粒酶RNA组分(TR), TERT和端粒酶相关蛋白（TEP1）3个亚单位组成［9］. 本实验证实, TC细胞可表达TERT mRNA，提示TERT可能是TC的发病机制之一.
　　
　　ASODN特异性抑制基因表达的能力的主要作用机制之一是与翻译起始密码子结合,通过一种直接的空间效应阻断核糖体与mRNA结合及翻译起始［10-11］. 本实验中，我们采用硫代修饰的ASODN(SASODN)，即核苷酸片段骨架磷上的羟基被巯基取代.  SASODN在胞核或胞质内与RNA结合，均可大量诱导激活核糖核酸酶H，促进对RNA的降解；无论在细胞内外，SASODN均具有很强的抗核酸酶活性［12］. FCM细胞周期分析显示ASODN能显著降低S期细胞的百分率，G1期细胞百分率增多，在G0/G1期前有一群DNA含量低的细胞形成的峰（凋亡峰）. ASODN处理组，SODN处理组及空白对照组的细胞凋亡率分别为10.4%, 1.6%及无凋亡，处理组与对照组比较有显著性差异(P<0.05). 本实验中，ASODN作用后TC细胞周期的变化与其生长抑制状态基本相符. SODN对TC细胞周期也表现一定作用，可能的原因是SODN片段进入细胞内产生的非特异性作用所致. 显微镜下凋亡细胞计数结果显示ASODN组凋亡细胞数明显高于空白对照组，这提示ASODN可能通过抑制TERT表达引起正常细胞凋亡. 用直接针对TERT的反义核酸作用于体外培养的人TC细胞，能够使肿瘤细胞生存能力较快速的下降，起到抑制细胞增殖和细胞凋亡的作用.

　　【】

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