不同复性方法制备的rhBMP

                           作者：赵玮钦，陈苏民，王涛，张晓楠，王丽

【关键词】  重组人骨形成蛋白2成熟肽；,高密度发酵；,蛋白质纯化；,蛋白质复性

　　Comparison of different refolding methods in inducing ectopic bone formation by rhBMP2m

　　【Abstract】 AIM: To refold recombinant human bone morphogenetic protein2 mature peptide (rhBMP2m) by different methods, and compare the activity of inducing the formation of ectopic bone. METHODS: The engineered strain, which could express rhBMP2m at a high level, was fermented in high density, and induced by temperature. The bacterial cells were collected and lyzed. The gained inclusion bodies were purified by ionexchange chromatography. The purified rhBMP2m was refolded by three different methods: ① rhBMP2m was dialyzed with pH 4.8 buffer for refolding. ② rhBMP2m was refolded by means of dilution method in pH 9.0 buffer. ③ rhBMP2m was dialysed in pH 6.5 buffer to refold. It (1 mg) was planted into mouse muscles to observe the formation of bone without any carrier. RESULTS: The purity of the acquired rhBMP2m was 98% after ionexchange chromatography. ① The resulting rhBMP2m was soluble after refolding with pH 4.8 buffer and had no any loss after passing through sterilizing filter membrane. When 1 mg of the lyophilized rhBMP2m was planted into mouse muscles, it induced ectopic cartilage after 2 weeks and trabecular bone after 4 weeks. ② rhBMP2m was soluble after refolding with pH 9.0 buffer. The refolded rhBMP2m seemed dissolvable by macroscopic observation, but lost over 90% after filtrating sterilization.After 1 mg of this lyophilized rhBMP2m was planted into muscles, cartilage appeared after 1 week, bone formed after 2 weeks, and trabecular bone was seen after 3 weeks. ③ After dialysis, rhBMP2m was precipitated. When 1 mg of insoluble rhBMP2m was planted into muscles, it induced trabecular bone in 2 weeks and myeloid cells after 4 weeks. CONCLUSION: Compared with acid and alkaline condition, rhBMP2m refolded in neutral condition has the best activity of inducing the formation of bone, but rhBMP2m refolded in acid condition has better dissolubility.

　　【Keywords】 human bone morphogenetic protein2 mature peptide; high density fermentation; protein purification; protein refolding

　　【摘要】 目的：用三种不同方法复性重组人骨形成蛋白2成熟肽(rhBMP2m)，比较其异位诱骨活性. 方法：将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达，裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化. 纯化后的rhBMP2m用三种不同方法复性：①对pH 4.8复性液透析复性；②对pH 9.0复性液稀释复性；③对pH 6.5复性液透析复性. 不加任何载体，1 mg复性后rhBMP2m直接植入小鼠肌肉观察诱骨生成. 结果：得到纯度为98％的rhBMP2m. ①pH 4.8透析复性后蛋白可溶. 经过滤除菌，可溶性rhBMP2m没有损失. 冻干后植入肌袋，2 wk后诱导生成软骨，4 wk诱导生成骨小梁. ②pH 9.0稀释复性后虽然肉眼观察蛋白似为可溶，但经除菌膜过滤rhBMP2m损失90%以上. 冻干后植入肌袋，1 wk诱导生成软骨，2 wk诱导软骨内成骨，3 wk出现骨小梁. ③pH 6.5透析复性后蛋白不可溶，植入肌袋，2 wk诱导生成骨小梁，4 wk后出现骨髓样细胞. 结论：相比酸性和碱性条件，中性条件下复性的rhBMP2m的诱骨活性最好，但酸性条件下复性的rhBMP2m溶解度好.

　　【关键词】 重组人骨形成蛋白2成熟肽；高密度发酵；蛋白质纯化；蛋白质复性

　　0　引言

　　重组人骨形成蛋白2成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein2 mature peptide, rhBMP2m)，属于转化生长因子β（transforming growth factorβ, TGFβ）超家族，它在骨骼再生与修复过程，以及胚胎发育的不同阶段发挥着重要的作用［1］. 目前，rhBMP2m已经被商业化生产并应用在多种临床研究中，包括骨质缺损、颌面修复等. 利用哺乳动物细胞制备rhBMP2m，其表达水平很低,纯化过程复杂，使得产品价格高昂，制约着其推广应用. 利用大肠杆菌表达rhBMP2m，获得包含体，体外复性后可以得到具有生物活性的rhBMP2m［2］. 但是其复性过程复杂，总收得率低，复性缓冲液所要试剂昂贵. 本研究采用三种不同的复性方法，通过动物试验比较不同方法复性的rhBMP2m的诱骨活性，为获得一种简单而且廉价的方法以改进活性rhBMP2m的生产.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　雄性健康昆明小鼠12只，体质量18~22 g，由第四军医大学实验动物中心提供；溶菌酶，DNaseⅠ购自美国Invitrogen公司；菌种DH5α/pDH2rhBMP2m，BCA蛋白定量试剂为第四军医大学生物化学与分子生物学教研室配制并保存；低分子量蛋白marker购自上海生化所； 15 L全自动发酵罐购自美国NBS公司；SPSepharose FF，QSepharose FF购自瑞典Pharmacia公司；低分子蛋白透析膜（截留分子量10 000）购自北京华美公司；超声粉碎器购自美国Cole Parmer Instrument公司；低温高速离心机购自湖南湘西仪器仪表厂；MinitanTM超滤系统购自美国MILIPORE公司；SDSPAGE垂直平板电泳系统购自美国BIORED公司；冻干机购自丹麦HETO公司； 0.22 μm微孔滤膜来自上海兴亚净化材料厂.

　　1.2方法

　　1.2.1DH5α/pDH2rhBMP2m

　　高密度发酵、裂菌、包涵体洗涤取-70℃保存的DH5α/pDH2rhBMP2m工程菌株甘油菌种， 划LB琼脂平板， 含100 mg/L氨苄青霉素， 32℃培养20 h. 挑单菌落入6 mL LB，30℃摇床培养16 h. 转入300 mL LB，30℃摇床培养10 h. 转入15 L发酵罐30℃培养,机自动控制搅拌、通气溶氧，30℃培养16 h. 发酵罐内42℃诱导表达4 h，结束发酵. 裂解缓冲液(100 g/L蔗糖，10 mmol/L pH 8.0 TrisHCL，1 mmol/L EDTA)悬浮菌体，加溶菌酶，冰浴中超声裂菌，离心后收得包涵体. 洗涤液(5 g/L TritonX100，10 mmol/L pH 8.0 TrisHCl，1 mmol/L EDTA)悬浮包涵体,超声处理,离心收集包涵体,反复4次.

　　1.2.2包涵体纯化

　　①SPSepharose FF阳离子柱层析分离：洗涤后的包涵体溶解于SPbuffer（8 mmol/L 尿素，20 mmol/L pH 6.5 磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L β巯基乙醇）中，上SPSepharose FF阳离子柱，用不同浓度NaCl溶液洗脱，透析除去尿素，离心收集沉淀. ②QSepharose FF阴离子柱层析纯化：将SPSepharose FF柱层析纯化的蛋白质沉淀溶解于Q buffer（8 mol/L 尿素，20 mmol/L pH 9.0 Tris，0.014 mol/L β巯基乙醇）中，上QSepharose FF阳离子柱，用不同浓度NaCl溶液洗脱，收集各蛋白峰，透析除去尿素和β巯基乙醇，离心收集沉淀.

　　1.2.3蛋白复性

　　①pH 4.8透析复性rhBMP2m：纯化后的rhBMP2m经变性液（8 mmol/L 尿素，20 mmol/L pH 6.5 磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L β巯基乙醇）溶解,装入透析袋内,对pH 4.8的复性液透析（10 mmol/L pH 4.8 NaAc，50 mmol/L NaCl），换液多次以彻底去除尿素和β巯基乙醇. 透析复性结束后收集复性蛋白液，复性的蛋白液可通过0.22 μm微孔滤膜除菌，或进一步浓缩和冰冻干燥.  ②pH 6.5透析复性rhBMP2m：纯化后的rhBMP2m经变性液（8 mmol/L 尿素，20 mmol/L pH 6.5 磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L β巯基乙醇）溶解,装入透析袋内，对pH 6.5的复性液透析复性24 h，换液2次以彻底去除尿素和β巯基乙醇. 透析复性结束后收集离心复性后沉淀的蛋白质.  ③pH 9.0稀释复性rhBMP2m：纯化后的rhBMP2m用变性液（8 mmol/L 尿素， 20 mmol/L TrisCl pH 8.5, 0.014 mol/L β巯基乙醇）溶解后，1次倾倒入10倍体积的复性液（20 mmol/L TrisCl pH9.0，0.5 mol/L精氨酸，10 mmol/L还原型谷胱甘肽，1 mmol/L氧化型谷胱甘肽），同时迅速搅拌均匀，保证蛋白浓度不高于0.2 mg/mL,在15~20℃放置24 h复性，用Minitan超滤系统浓缩和除盐，并可进一步冰冻干燥.

　　1.2.4蛋白定量［3］

　　用NaOH 0.1 mol/L将BSA标准品（1 mg/mL）稀释成梯度浓度：1000，800，600，400，200，0 mg/mL，同样将蛋白样品倍比稀释至适当浓度(0~1000 mg/mL). 样品、梯度标准品各50 mL，分别加入200 mg/mL工作液（工作液A和B以50∶1的比例均混合），混匀后37℃水浴30 min，以ELISA reader测A562 nm (或A570 nm) 吸光值. 作图画出标准校正线，并决定未知样本的浓度.

　　1.2.5小鼠肌袋试验

　　实验动物随机分为4组（每组3只）：正常对照组，pH 4.8复性组，pH 6.5复性组和pH 9.0复性组. 以无菌手术分别在小鼠股部肌肉植入不同方法复性后rhBMP2m蛋白沉淀1 mg. 2，3和4 wk分别取局部组织做病理切片，观察诱骨情况.

　　2　结果

　　2.1DH5α/pDH2rhBMP2m发酵及包涵体纯化

　　发酵罐中DH5α/pDH2rhBMP2m培养16 h和诱导表达4 h后,测发酵液A600 nm=43.5；发酵液中rhBMP2m占细菌总蛋白量的42％. 包涵体中rhBMP2m纯度为85%. 包涵体经SPSepharose FF柱层析，目的蛋白出现在0.28 mol/L及0.78 mol/L的氯化钠溶液洗脱峰内. 蛋白回收率为67％，rhBMP2m纯度为91%. 目的蛋白位于0.45 mol/L的氯化钠洗脱峰内. 透析除去尿素，离心收集蛋白,蛋白回收率为85％，rhBMP2m的纯度达到98％. 经阳离子柱和阴离子柱纯化后，目的蛋白的总回收率为48％.

　　2.2rhBMP2m对pH 4.8复性液透析

　　复性复性后蛋白为可溶性，将溶液浓缩到20 mg/mL亦无沉淀出现；用微孔滤膜过滤除菌后，可溶性rhBMP2m也没有损失. 复性蛋白中二聚体含量为39％；过滤前后样品的电泳图象没有区别，表明过滤除菌后不论单体和多聚体都没有损失，完全可溶（图1）.

　　2.3rhBMP2m pH 6.5复性液透析

　　复性复性产物为不可溶性蛋白. 复性产物中二聚体占总蛋白量的22％（图2）.

　　2.4纯化后的rhBMP2m pH 9.0中稀释复性

　　复性后蛋白液肉眼观察透明无色，但经0.2 μm微孔滤膜过滤除菌后，rhBMP2m损失90%以上. 浓缩可到蛋白浓度1 mg/mL，再继续浓缩会出现沉淀. 复性蛋白中二聚体占总蛋白量的21％（图3）.

　　2.5pH 4.8复性产物小鼠肌袋试验

　　直接将pH 4.8复性的可溶性rhBMP2m注射入小鼠肌肉，未见诱导骨或软骨的生成. 蛋白液冻干后植入小鼠肌肉，2 wk后诱导肌肉间质细胞生成软骨，4 wk后诱导生成骨小梁（图4）.

　　2.6pH 6.5复性产物小鼠肌袋试验

　　pH 6.5复性的rhBMP2m蛋白植入小鼠肌肉2 wk后即可诱导肌肉间质细胞在未被吸收的蛋白周围生成骨小梁；3 wk后骨小梁进一步塑型；4 wk后出现骨髓样细胞（图5）.

　　2.7pH 9.0复性产物小鼠肌袋试验

　　pH 9.0复性的rhBMP2m蛋白液冻干后植入小鼠肌肉，1 wk后诱导肌肉间质细胞生成软骨；2 wk后诱导软骨内成骨；3 wk后诱导生成骨小梁(图6).A：2 wk后诱导生成骨小梁；B：3 wk后骨小梁进一步塑型；C：4 wk后出现骨髓样细胞.
图5pH 6.5透析复性rhBMP2m 1 mg植入小鼠肌内的组织学检查×100

　　3　讨论

　　利用大肠杆菌来大量生产重组蛋白是一种快速、的方法，但产物常以包含体形式存在. 以包含体形式生产重组蛋白具有许多优点，例如蛋白产量高，目的蛋白不易被降解，易于纯化. rhBMP2m经大肠杆菌高表达，目的蛋白含量可以达到总蛋白量的40％，主要以包含体形式存在.

　　包含体中的多数蛋白不能正确折叠，没有活性. 虽然已有多种蛋白的包含体被正确复性，但不同的蛋白需要不同的复性条件，研究特定蛋白的复性条件是一项复杂而又困难的任务［4］. 蛋白的复性和聚集程A：1 wk后诱导生成软骨；B：2 wk后诱导软骨内成骨；C：3 wk后诱导生成骨小梁.

　　度依赖多种因素：蛋白浓度、去污剂、温度、pH、氧化还原环境、离子强度、二价阳离子、促溶剂等. rhBMP2m含有大量的疏水性氨基酸残基，蛋白的溶解度差，不利于对复性蛋白进行过虑除菌，而采用轱60射线照射除菌易造成蛋白活性损失［5］. 在本研究中，虽然三种不同的复性方法的复性液成分有所不同，但主要比较了不同pH环境对复性结果的影响，并通过体外植入实验比较了不同方法复性的rhBMP2m的诱骨活性. 通过比较发现，酸性条件下复性后，虽然蛋白活性不是最好，但蛋白具有最好的溶解度，可以进行过虑除菌. 可能由于rhBMP2m的等电点接近中性，偏离等电点有利于rhBMP2m的溶解，而酸性条件下rhBMP2m的溶解度更好. 我们采用透析复性法和稀释复性法，通过比较发现：透析复性法操作简单，复性后蛋白易回收，而且成本低廉；稀释复性法操作繁琐，复性后蛋白需进一步浓缩，易造成损失. 这提示在rhBMP2m生产过程中，复性后的蛋白既要具有好的诱骨活性且无菌，还要尽可能降低生产成本. 我们认为，在酸性条件下进行透析复性适合rhBMP2m的大规模生产. 这种方法在复性、纯化其他二聚体蛋白时，例如TGFβ超家族，同样具有潜在的应用价值.

　　【】

　　［1］Singh K, Smucker JD, Boden SD. Use of recombinant human bone morphogenetic protein2 as an adjunct in posterolateral lumbar spine fusion: A prospective CTscan analysis at one and two years ［J］. J Spinal Disord Tech, 2006,19(6):416-423.

　　［2］Vallejo LF, Brokelmann M, Marten S, et al. Renaturation and purification of bone morphogenetic protein2 produced as inclusion bodies in highcelldensity cultures of recombinant Escherichia coli ［J］. Biotech, 2002, 28(3): 185-194.

　　［3］杨安钢，毛积芳，药立波. 生物化学与分子生物学实验技术［M］. 北京：高等出版社，2001: 245-247.

　　［4］Kubler NR, Moser M, Berr K, et al. Biological activity of E. coli expressed BMP4［J］. Mund Kiefer Gesichtschir, 1998, 27(5): 149-152.

　　［5］Uludag H, Gao T, Porter TJ. Delivery systems for BMPs: Factors contributing to protein retention at an application site［J］. J Bone Joint Surg Am, 2001, 83(2):128-135.