非病毒载体负载增强型绿色荧光蛋白转染永生化神经前体细胞

                                                            作者：桂伶俐，刘志恒，张传汉，高峰

【关键词】  绿色荧光蛋白质类；,基因表达；,转染；,神经前体细胞

　　Transfection of enhanced green fluorescent protein into immortalized neural progenitor cells by nonviral vectors

　　　【Abstract】 AIM: To investigate an effective transfection method of nonviral vectors and the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in the transfected immortalized neural progenitor cells (INPC). METHODS: The plasmid EGFPC1 was transfected into INPC by three different nonviral vectors respectively, including Lipofectamine 2000, TRANSfection and Sofast. The expression of EGFP and the transfection efficiency of the 3 vectors were measured at 24 h after transfection. The transfection efficiency of the vector which was the most efficient, was detected 12, 24, 48 and 72 h after transfection to determine the expression peak of EGFP. The viability of transfected and nontransfected cells was measured by trypan blue rejection test. After the plasmid EGFPC1 was transfected into INPC, the stable cell clone designated INPC/EGFP was isolated by G418 selection. The positive rate of EGFP was observed. And the specific molecular marker of neural progenitor cells, nestin, was detected using immunocytochemistry. After INPC/EGFP was induced by 50 mL/L fetal bovine serum, the cell morphology and the expression of EGFP were observed in the differentiated cells. RESULTS: The transfection efficiency of Lipofectamine 2000, TRANSfection and Sofast was (25.5±2.9)%, (4.0±1.7)%, (7.9±1.4)% respectively, at 24 h after transfection. And Lipofectamine 2000 was the most efficient. Its transfection efficiency at 12, 24, 48 and 72 h after transfection was (17.1±0.7)%, (25.5±2.9)%, (19.4±0.9)%, (15.6±1.4)%, respectively. The expression of EGFP was the highest at 24 h after transfection. The positive rate of EGFP was 95% in INPC/EGFP. And INPC/EGFP was still nestin positive. The differentiated cells presented as neurons or astrocytes, and EGFP was still found in their somas and processes. CONCLUSION: Extrinsic genes can be effectively transfected into INPC by Lipofectamine 2000. And EGFP is one of the valuable tracking tools for INPC.

　　【Keywords】 green fluorescent protein; gene expression; transfection; neural progenitor cell

　　【摘要】 目的: 寻找能高效转染永生化神经前体细胞(INPC)的非病毒载体，观察转染后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达. 方法: 用阳离子脂质体Lipofectamine 2000，TRANSfection或阳离子聚合物Sofast分别负载质粒EGFPC1转染INPC，利用荧光显微镜检测转染后24 h的转染效率. 对转染效率最高的一种载体，观察其转染后12，24，48和72 h转染效率，确定EGFP表达最高峰. 用台盼蓝排斥试验检测转染和未转染细胞的活力. 质粒EGFPC1转染INPC后，经G418筛选，挑选细胞克隆，命名为INPC/EGFP,观察其EGFP阳性率. 应用巢蛋白抗体鉴定INPC/EGFP. 50 mL/L胎牛血清诱导INPC/EGFP分化，观察分化后细胞的形态及EGFP表达. 结果: Lipofectamine 2000，TRANSfection和Sofast转染INPC后24 h，转染效率分别为(25.5±2.9)%，(4.0±1.7)%，(7.9±1.4)%. Lipofectamine 2000的转染效率最高. 其转染后12，24，48和72 h的转染效率分别为(17.1±0.7)%，(25.5±2.9)%，(19.4±0.9)%，(15.6±1.4)%，EGFP在转染后24 h表达最高. INPC/EGFP中，EGFP阳性率约为95%. INPC/EGFP巢蛋白表达阳性，其分化后呈神经元或星形胶质细胞样，且胞体及突起中仍可见绿色荧光.  结论: Lipofectamine 2000可高效转染INPC. EGFP是INPC理想的示踪方法之一.

　　【关键词】 绿色荧光蛋白质类；基因表达；转染；神经前体细胞

　　0　引言

　　永生化神经前体细胞（immortalized neural progenitor cell, INPC）具有自我更新、无限增殖及多向分化的潜能，且较原代神经前体细胞易行基因操作，成为神经系统损伤细胞替代及基因的理想靶细胞［1］. 而选择高效的外源基因导入系统对基因治疗的效果至关重要. 尽管病毒介导的基因转染具有更佳的转染效率［2］，但由于其安全性和技术方面的原因,探讨高效率的非病毒载体基因转染方法更具意义. 本实验拟以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)为报告基因， 采用不同种类阳离子脂质体或阳离子聚合物转染大鼠INPC, 检测其转染效率， 并观察EGFP的表达， 以期寻找转染效率较高的非病毒载体及理想的INPC示踪方法.

　　1　材料和方法

　　1.1材料

　　Neurobasal，B27添加剂，胎牛血清购自美国GIBCO公司；碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）购自英国PeproTech公司；多聚鸟氨酸、明胶购自美国SIGMA公司； Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；TRANSfection购自北京天为时代公司；Sofast购自北京天来公司；巢蛋白抗体购自美国NeoMarkers公司；免疫组化试剂盒购自北京中山公司；质粒提取试剂盒购自上海华舜公司；携带质粒EGFPC1（美国BD公司）的菌种由同济麻醉学教研室保存.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养SV40大T抗原基因转染

　　原代大鼠神经前体细胞后建立的INPC，由同济医院麻醉学教研室构建并保存［1］. INPC应用含20 mL/L B27，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF的无血清Neurobasal培养基，在预先采用10 mg/L多聚鸟氨酸和2 g/L明胶包被的六孔板中贴壁培养.

　　1.2.2质粒的制备及基因转染

　　将携带EGFPC1质粒的菌种接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，振摇12 h，按试剂盒操作说明提取质粒，采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法确定质粒的纯度与浓度. 分别参照阳离子脂质体Lipofectamine 2000，TRANSfection及阳离子聚合物Sofast的说明书进行转染（转染试剂与质粒按说明书推荐量）. 将两者混合物轻轻滴加于汇合率为80%～90%的INPC中，继续培养5 h后换液. 每组设3 个复孔. 转染后24 h，倒置荧光显微镜观察EGFP的表达. 分别记录每个转染细胞培养孔随机5个视野内明视野和暗视野所观察到的细胞数. 转染效率（%）＝暗视野发绿色荧光细胞数/明视野细胞数×100%. 对转染效率最高的一种载体，在转染后12，24，48和72 h观察转染效率.

　　1.2.3台盼蓝排斥试验检测

　　细胞活力取出同期培养的未转染和转染刚结束的细胞培养板，室温下用0.4 g/L台盼蓝溶液染色10 min. 显微镜下随机取培养孔5个视野. 未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞. 活细胞率（%）＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%.

　　1.2.4稳定转染EGFPC1质粒的INPC的筛选及鉴定

　　EGFPC1质粒经Lipofectamine 2000介导转染INPC后24 h传代，转染后48 h加入G418 200 μg/mL筛选14 d，通过倒置荧光显微镜挑选阳性克隆，命名为INPC/EGFP，并EGFP阳性细胞百分率. INPC/EGFP行巢蛋白免疫细胞化学染色. 加入50 mL/L胎牛血清诱导INPC/EGFP分化7 d，观察细胞形态及EGFP的表达.

　　统计学处理： 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示,组间比较用单因素方差分析后Duncan检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2　结果

　　2.1非病毒载体转染INPC的转染效率

　　三种非病毒载体Lipofectamine 2000，TRANSfection和Sofast负载EGFPC1质粒转染INPC后24 h，转染效率分别为(25.5±2.9)%，(4.0±1.7)%，(7.9±1.4)%，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05，图1）. Lipofectamine 2000的转染效率最高.
A: 阳离子脂质体Lipofectamine2000; B: 阳离子脂质体TRANSfection; C: 阳离子聚合物Sofast.

　　2.2Lipofectamine 2000转染INPC后不同时间点的转染效率
　　Lipofectamine 2000转染后12，24，48和72 h转染效率分别为（17.1±0.7）%，（25.5±2.9）%，（19.4±0.9）%，（15.6±1.4）%，组间比较差异有统计学意义(P<0.05）. EGFP表达最高峰在转染后24 h.

　　2.3转染对细胞活力的影响

　　台盼蓝排斥试验检测未转染细胞和Lipofectamine 2000，TRANSfection及Sofast转染刚结束后活细胞率，分别是（97.0±1.0）%，（95.7±1.2）%，（96.0±1.0）%，（95.7±0.6）%，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05）.
2.4INPC/EGFP中EGFP阳性率转染EGFPC1质粒后，经G418筛选所得细胞克隆INPC/EGFP中，EGFP阳性率约为95%，EGFP荧光均匀地充满胞浆和胞核（图2）.

　　2.5INPC/EGFP的鉴定及EGFP的表达

　　INPC/EGFP的细胞形态及生长特性较INPC无明显改变，仍以椭圆形或三角形为主，有2~3个突起，胞核圆形、较大，而胞质较少（图3A）. 其巢蛋白免疫细胞化学染色仍呈胞浆阳性（图3B）. 其分化7 d后，可观察到大量不同形态的新生神经细胞，呈现为具有1～2个细长突起的神经元样或多个粗短突起的星形胶质细胞样形态. 荧光显微镜下观察到分化后细胞的胞体与纤细突起仍表达EGFP（图3C）.

　　3　讨论

　　目前，非病毒转染法中以阳离子脂质体和阳离子聚合物呈现显著优势［3-4］，影响它们转染效率的因素众多. 本实验中，细胞种类、细胞密度、质粒及转染时间均相同，并参照说明书给予推荐量的转染试剂及质粒DNA,则转染效率主要取决于阳离子脂质体的结构或阳离子聚合物的种类. 本研究采用常用转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine 2000，TRANSfection和阳离子聚合物Sofast分别介导INPC的基因转染，发现这三种非病毒载体细胞毒性都很低，且Lipofectamine 2000的转染效率最高，可超过20％. 虽然，高峰等［2］发现利用EGFP重组腺相关病毒转染INPC，可得到高达90％的转染效率，但由于其安全性和技术方面的原因, Lipofectamine 2000仍不失为一种有效而简便的转染方法.
A: INPC/EGFP细胞形态; B: INPC/EGFP巢蛋白免疫细胞化学染色; C: INPC/EGF分化后荧光显微镜观察EGFP的表达.

　　EGFPC1质粒经Lipofectamine 2000转入细胞后逐步转录翻译EGFP，所以12～24 h EGFP表达逐渐升高，到24 h最高，提示INPC瞬时转染后，基因表达检测最好在转染后24 h进行. 但同时，被导入外源基因的靶细胞代谢发生改变,生长缓慢，转染后有些细胞正常分裂,而另一些的细胞周期则延长,这些都影响了转染后瞬时的表达，所以转染后48～72 h EGFP表达降低. 而高峰等［2］发现利用EGFP重组腺相关病毒转染INPC后，EGFP至转染后72 h表达最高. 这说明病毒或非病毒载体所负载的外源基因转染有不同的时程特点.

　　INPC中，虽然非病毒载体的瞬时转染效率不如病毒载体高，但经过抗性筛选可极大提高外源基因的表达，如INPC/EGFP细胞株EGFP的阳性率可高达95%. 这是因为INPC是大T抗原转化细胞，质粒可在细胞中复制, 所以易于筛选出高表达外源基因的稳定细胞克隆.
　　
　　本研究中，EGFPC1质粒转染INPC后，EGFP表达迅速而持久，可反映细胞形态的全貌，能在活细胞中直接观察，具有操作简便、可视性强并且不需要外源底物等优点［5-6］. EGFPC1质粒导入INPC后，不影响其前体细胞特性，且分化后的细胞不仅胞体而且细小的突起仍可发出较强的绿色荧光. 因此，EGFP可作为INPC良好的示踪手段.

　　综上所述，本研究证实Lipofectamine 2000可高效转染INPC. EGFP是INPC理想的示踪方法之一. 这为神经前体细胞在基因中的运用及其移植后的示踪技术奠定了基础.

　　【】

　　［1］高峰, 田玉科, 杨辉, 等. 猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建［J］. 中华麻醉学杂志, 2005, 25(8): 597-600.

　　［2］高峰, 田玉科, 杨辉, 等. 增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达［J］. 第四军医大学学报, 2006, 26(3): 215-217.

　　［3］De Smedt SC, Demeester J, Hennink WE. Cationic polymer based gene delivery systems［J］. Pharm Res, 2000, 17(2): 113-126.

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　　［6］李美山, 张成, 陈松林, 等. 绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达［J］. 第四军医大学学报, 2006, 26(9): 813-817.