表皮葡萄球菌全面调节子的表达在生物被膜耐药性中的作用

                                                作者：贾宁，徐志凯，袁云娥，索继江，邢玉斌

【关键词】  表皮葡萄球菌；,生物膜；,实时定量;,逆转录聚合酶链反应

　　Relationship between expressions of global regulators and erythromycin resistance of Staphylococcus epidermidis biofilm

　　【Abstract】 AIM: To explore the relationship between the expressions of global regulators and the erythromycin resistance of Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) biofilm. METHODS: The expressions of global regulators (agr, sarA and sigB) in biofilm cells of S. epidermidis 1457 with and without erythromycin resistance were detected by SYBR green I realtime RTPCR.  RESULTS: The expressions of agrD and RNAIII were significantly higher in biofilm cells than those in planktonic cells in both erythromycin and nonerythromycin groups （P<0.05）. The expression of sarA in biofilm cells was significantly higher than that in planktonic cells, but there was no significant difference in biofilm cells between erythromycin group and nonerythromycin group. The expression of sigB and its active regulation gene asp23 in biofilm cells showed no significant difference between erythromycin and nonerythromycin groups (P>0.05).  CONCLUSION:  agrD and RNAIII take part in quorumsensing regulation, which suggests that quorumsensing system plays an important role in erythromycin resistance of S. epidermidis biofilm.

　　【Keywords】 Staphylococcus epidermidis; biofilm; realtime quantitative; RTPCR

　　【摘要】 目的：探讨表皮葡萄球菌全面调节子的表达在生物被膜耐药性中的作用.   方法：采用实时荧光定量RTPCR对表皮葡葡球菌1457生物被膜内细菌红霉素作用前后全面调节子(agr, sarA, sigB)的表达进行检测. 结果：在表皮葡萄球菌1457中，agrD和RNAⅢ在膜内菌中的表达均高于浮游菌，且红霉素作用24 h后的表达高于作用前（P<0.05）；sarA膜内菌的表达高于浮游菌（P<0.05），但红霉素作用前后的表达无统计学差异（P>0.05）；膜内菌sigB和反应sigB 调控的活性基因asp23的表达红霉素作用前后无统计学差异（P>0.05）. 结论：由于agrD和RNAⅢ参与群体效应系统的调节，提示群体效应调节在红霉素耐药性增加中起着重要作用.

　　【关键词】 表皮葡萄球菌；生物膜；实时定量;逆转录聚合酶链反应

　　0　引言

　　表皮葡萄球菌吸附于机体粘膜或插管、人工关节等生物医学材料表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂多糖等多糖复合物，相互粘连并克隆产生生物被膜. 生物被膜的产生使膜内菌对抗生素的耐药性比浮游菌增加10~1000倍, 其引发的感染常常只有移走植入物才能控制［1］. 生物膜内细菌如何形成对抗生素的耐药性，目前还不十分清楚，相关的研究报道较少. 不同的生物被膜的组成和不同的抗生素，其耐药机制也不相同［2-3］. 我们采用实时荧光定量RTPCR检测表皮葡葡球菌1457不同状态下基因表达水平，探讨表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素的耐药机制.

　　1　材料和方法

　　1．1材料

　　表皮葡萄球菌1457为iCa+的产生物被膜菌，由Micheal Otto教授惠赠，红霉素最小抑菌浓度为0.25 μg/mL.  表皮葡萄球菌过夜摇动增菌并稀释至吸光度为0.2（A600 nm）；取5 μL接种于培养基（含蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，葡萄糖1 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾1 g/L）平板上的0.2 μm聚碳酸酯微孔滤膜上（直径约25 mm），35℃孵育48 h，滤膜及所生成的生物被膜每隔12 h转移到新的平板上［4］. 聚碳酸酯微孔滤膜（Whatman Inc，USA）购于联星生物有限公司，使用前121℃高压15 min.

　　1．2方法

　　1．2．1总RNA的提取

　　按Qiagen RNA提取试剂盒说明书提取总RNA. 使用RNasefree DNase set 去除样品中的基因组污染； 用50 μL RNasefree water洗脱RNA, 加入 RNA酶抑制剂； 纯化的RNA  -20℃保存.

　　1．2．2实时荧光检测

　　采用Takara实时荧光定量PCR试剂盒进行实时定量PCR检测agrD, RNA III, sigB, asp23, sarA基因的表达. PCR引物由大连宝生物合成. 使用1457浮游菌总RNA样品转录成cDNA梯度稀释为10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 g/μL作为标准品，进行PCR反应，制作16S rRNA标准曲线和cDNA梯度稀释为10-8~10-12 g/μL,作为标准品，制作目的基因的标准曲线. 检测各标本Ct值，根据标准曲线样品目的基因的浓度，分别用16S rRNA和1457浮游菌各目的基因表达量进行校准获得相对表达量. 使用没有逆转录的反应作为对照,鉴别是否有基因组污染. 操作时每份样品重复3次. RT反应：42℃ 10 min，95℃ 2 min；PCR反应：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，45个循环.

　　统计学处理：采用Chiss（奇思）2004统计软件进行组间ttest或t′test，对组内作用前后比较用配对t检验进行统计分析.

　　2　结果

　　2．1总RNA提取

　　表皮葡萄球菌总RNA提取(图1). 实时RTPCR标准曲线相关系数为0.997.

　　2．2基因相对表达量

　　在表皮葡萄球菌1457中，agrD和RNAⅢ在膜内菌中的表达均高于浮游菌，且红霉素作用24 h后的表达高于作用前（P<0.05）；sarA膜内菌的表达高于浮游菌（P<0.05），但红霉素作用前后的表达无统计学差异（P>0.05）；膜内菌sigB和反应sigB调控活性的基因asp23的表达红霉素作用前后无统计学差异（P>0.05，表1）.表1实时荧光定量RTPCR检测表皮葡萄球菌1457不同状态下基因表达水平（略）

　　3　讨论

　　同金黄色葡萄球菌一样，全面调节子在表皮葡萄球菌致病性中起着非常重要的作用，主要包括附属基因调节子agr，附属调节蛋白sarA和sigB.  agr广泛存在于表皮葡萄球菌中，参与许多毒性因子的调控［4-6］. agr位点包含作用相反的启动子P2和P3，分别表达RNAⅡ和RNAⅢ 转录本. RNAⅡ编码四个agr介导的毒性因子调节所需的蛋白AgrB, AgrD, AgrC,AgrA，AgrD和AgrB作用产生一种辛肽化合物，即自身诱导肽，参与群体效应调节,当这种辛肽化合物胞外浓度达到阈值时，激活感应器AgrC和调节器 AgrA. 激活的AgrA可上调RNAⅡ和RNAⅢ，RNAⅢ是agr反应的效应器分子，在一定程度上，其表达在细菌对数晚期和静止期可上调细胞外毒性因子的产生和下调细胞壁表面相关蛋白的转录主要作用于转录水平，但其如何调节目的基因目前还不十分清楚. RNAⅢ还可编码产生δ毒素的结构基因［5,7］. 为了解全面调节子agr在表皮葡萄球菌生物膜对红霉素耐药性中的作用，我们采用实时荧光RTPCR对表葡1457浮游菌、表葡生物膜红霉素作用前与作用后agrD, RNA Ⅲ表达进行了检测，结果显示在表皮葡萄球菌1457中，agrD和RNAⅢ膜内菌中的表达均高于浮游菌，且红霉素作用后的表达高于作用前（P<0.05）；由于agrD的表达与参与群体效应调节的自身诱导肽密切相关［5］，而RNA Ⅲ是agr反应的效应器分子，提示群体效应调节在红霉素耐药性增加中起着重要作用. Yao等［8］发现表皮葡萄球菌中agr介导的群体效应的调节是保护细菌逃逸人体防御系统攻击的主要原因，其调控与抗微生物肽相关的可降解胞外酶和氧化应激反应因子等一系列毒性因子，使细菌尽快适应环境，进而保护细菌在体内生存. 除了agr以外，Xu等［9］首次报道在表皮葡萄球菌存在另一群体效应系统与生物膜的产生相关，生物膜的luxS突变株生物膜的形成增加，且在大鼠模型中生物膜感染加重，虽然参与调控的因子与agr不同，但作用非常相似.

    附属调节蛋白SarA在金葡菌中参与100多个基因的调控，是非常重要的致病因子，表皮葡萄球菌附属调节蛋白SarA与金葡菌SarA有84%的同源性［7，10］, 由于在表皮葡萄球菌中控制SarA表达的3个启动子的排列顺序与金葡菌不同，因而对于表皮葡萄球菌中SarA所参与致病性的调节作用是否与金葡菌相同目前还在研究之中. 本实验中膜内菌SarA的表达高于浮游菌，可见SarA的高表达与生物被膜的形成有关，这与Tormo等［10］报道证实SarA是表皮葡萄球菌生物被膜形成中的基本的正调节子，对ica 位点起正调控作用相符. 但红霉素作用前后SarA的表达无显著性差异，提示膜内菌红霉素耐药性的增加与SarA相关性不显著.

　　表皮葡萄球菌中另一个全面调节子sigB是可替换σ因子,其水平及活性随环境压力而调节，与金黄色葡萄球菌和枯草杆菌sigB操纵子同源性很高，由4个ORFs (ORF2ORF5)组成，排列为rsbUrsbVrsbWsigB. RsbU为sigB的正调节因子， asp23, coa, clfA, sarH1和sarA 的P3启动子等一系列毒性相关基因的转录后调节与游离的SigB水平相关［11］. 但本实验结果显示表葡膜内菌中sigB及其调控活性的基因asp23的表达在红霉素作用前后没有显著性差异，与膜内菌红霉素耐药性的增加相关性不显著.

　　【】

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　　［8］Yao Y, Vuong C, Otto M, et al. Characterization of the Staphylococcus epidermidis accessorygene regulator response: Quorumsensing regulation of resistance to human innate host defense ［J］.  J Infect Dis, 2006,193(6):841-848.

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