钙依赖性磷脂结合蛋白Annexin Ⅱ的研究进展

【关键词】  Annexin,Ⅱ；钙离子；磷脂类；癌

　　【摘要】 Annexin Ⅱ是Annexins超家族中A亚家族的重要成员，具有钙离子介导的磷脂结合特性. 主要表达在人体内皮细胞、单核/巨噬细胞、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中. 本文着重就Annexin Ⅱ的基因结构、蛋白结构、生物学功能及其与疾病的关系进行阐述. 

　　【关键词】Annexin Ⅱ；钙离子；磷脂类；癌

　　0引言

　　Annexin Ⅱ，又名P36, ANX2, LIP2, LPC2, CAL1H, LPC2D, ANX2L4, PAPIV. 其基因位于15q21q22，Mr为36×103，在人体内皮细胞、单核／巨噬细胞、骨髓细胞和某些肿瘤细胞中表达丰富. Annexin Ⅱ最早是在劳氏肉瘤病毒/鸡胚成纤维细胞中作为酪氨酸蛋白激酶的作用底物而被发现的［1］. 后来研究表明，Annexin Ⅱ具有Ca2+依赖性结合磷脂、细胞骨架蛋白的重要特性，从而将其归入Annexins 蛋白超家族的Ａ亚家族中，命名为Annexin A2［2］. 尽管已发现Annexins家族成员多在细胞生长和信号转导的调节方面发挥作用，但Annexin Ⅱ的具体生物学功能还不清楚. 实验表明，Annexin Ⅱ与人类许多疾病的发生相关，尤其在肿瘤、心血管疾病中的作用机制成为当前的研究热点［3］. 本文重点综述Annexin Ⅱ的生物学功能及其与人类疾病的关系.

　　1Annexin Ⅱ的基因和蛋白结构

　　人Annexin Ⅱ 的结构基因位于15q21q22，含1.4 kb编码基因，并有三个假基因分别位于4号、9号、10号染色体上. 人Annexin Ⅱ结构基因含13个外显子和12个内含子. 现已发现几种不同的转录变异体［4］.
 　　
　　Annexin Ⅱ由339个氨基酸残基组成，是Annexins家族A亚家族成员. 与该家族其他成员一样，它在结构上具有一个保守的羧基末端和一个可变的氨基末端. 保守的羧基末端一般具有四个Annexin重复子，每一重复子由大约七十个高度保守氨基酸残基构成. 每一重复子有五个α螺旋结构，它们堆叠成致密的圆盘状. 该结构域具有结合钙离子的能力，从而调节Annexin分子与磷脂分子的结合，故被称为所有Annexins家族成员的核心区域［5］. 这种结构不同于钙调蛋白，肌钙蛋白等的EF臂型钙离子结合位点，而有自己特殊的模序结构［6］，即钙离子结合蛋白后，再与带负电荷的磷脂分子极性头部结合. AnnexinⅡ氨基端的前十四个氨基酸残基形成两性α螺旋结构提供了S100A10（p11）的结合位点，从而形成A2S100A10复合物的结构基础，除形成复合物，氨基端部分还有其他功能，如结合内体，与组织纤溶酶原激活物反应，作为磷酸激酶的作用底物等.
　　
　　1996年，Burger等人通过X射线衍射实验，观察到了截去N端三十个氨基酸残基的Annexin Ⅱ晶体结构，其表现为曲面结构，凹面有肽链的氨基端及羧基端，凸面含有钙离子磷脂结合位点. Anja Rosengarth等为进一步从结构上阐明Annexin Ⅱ与其主要结合物S100A10的结合机制再次通过X射线衍射观察到了全长Annexin Ⅱ的晶体结构，如图1所示.
　
　　Annexin Ⅱ 主要有单体、二聚体、四聚体三种存在形式. 二聚体是Annexin Ⅱ与三磷酸甘油酸激酶的结合物，四聚体则由两个Annexin Ⅱ亚基和S100A10(p11)二聚体结合而成.

　　图1Annexin Ⅱ的丝带模型.  左图和右图分别显示全长结构和氮端部分删除结构. 重复子及钙离子结合位点已标注［略］

　　2Annexin Ⅱ的生物学功能

　　2．1Annexin Ⅱ与膜的融合细胞膜融合是真核细胞中的一种重要生物现象. 膜融合是物质运输的基础，如分泌蛋白从内质网运输到高尔基复合体，以衣被小泡形式，通过膜融合方式将内容物释放到高尔基复合体内，又如运输小泡与质膜融合实现了物质的内吞和外吐. Annexin Ⅱ 在膜融合过程中起到了介导生物膜聚集的作用. Annexin A2S100A10四聚体在Ca2+浓度很低的情况下就能够聚集膜结构并使之融合. Annexin Ⅱ单体以羧基端核心区域结合膜结构，同时氨基末端又有S100A10结合位点，二聚化的S100A10起到桥梁作用，把已结合磷脂膜的Annexin Ⅱ拉拢到一起，实现聚集融合膜结构的功能. 在含有转铁受体的内体循环中，Annexin Ⅱ以四聚体形式介导了质膜循环［8］.  另有研究显示，在Annexin Ⅱ的膜融合功能还可通过两个分子的同聚化形成的. 二聚化的分子呈反向平行结构，从而拉拢质膜，如图2，3所示，可能有三种途径： ① Annexin Ⅱ通过钙离子二聚化再分别与膜结合；② Annexin Ⅱ先在钙离子介导下与膜结合，再二聚化，最后结合另一部分膜使膜聚集；③ Annexin Ⅱ先在钙离子介导下与膜结合，再募集另一个已与膜结合的单体分子从而实现膜聚集［7］.

　　图2Annexin Ⅱ与S100A10形成四聚体介导生物膜聚集的过程［5］　略

　　图3Annexin Ⅱ 同源二聚化介导生物膜聚集的三种可能的途径［8］　略
　　
　　2．2Annexin Ⅱ与mRNA的特异性结合人们早已发现Annexin Ⅱ在病毒转化的细胞系和人某些肿瘤组织中表达上调. 最近对七种Annexin蛋白测试证明仅Annexin Ⅱ具有特异性结合RNA的特性. Annexin Ⅱ无论是以单体还是以四聚体形式，都可在钙离子介导下特异与mRNA中的poly G结合. 两者结合的部位可能是位于Annexin Ⅱ羧基末端一些特殊模序结构，如RNP模序，富含精氨酸的模序，双链RNA模序、KH模序、RGG盒、锌指结构. Annexin Ⅱ与HeLa, LNCaP肿瘤细胞中的cmyc癌基因的mRNA结合可延长其半衰期，从而使cmyc蛋白表达上调［9］.
 　　
　　2．3Annexin Ⅱ参与DNA生物合成Annexin Ⅱ可与三磷酸苷油酸酯激酶形成二聚体复合物. 这一复合物是DNA合成过程中的引物识别复合物（Primer Recognition Proteins,  PRP）. DNA复制过程中，双链DNA解螺旋，领头链和随从链分别由不同的DNA聚合酶催化得以复制. 其中随从链合成有赖于DNA polα. 少量Annexin Ⅱ有结合DNA尤其是ZDNA的能力，同时它可作为PRP中的组分激活DNA polα的活性. 实验观察显示，PRP使引物与模版以较低比例完成DNA复制，提高了复制的效率. 更进一步研究表明PRP与复制因子C复合物结构类似，它们都既能使复制叉中领头链和随从链的复制相互协调进行，又能促进模板引物相互识别［10］.
 
　　2．4Annexin Ⅱ与纤溶系统AnnexinⅡ介导的纤溶酶原激活机制，可能有赖于其羧基末端的赖氨酸残基(Lys307). AnnexinⅡ结构上的显著特点使其可作为纤溶酶原（plasminogen PLG）和组织纤溶酶原激活物（tissue plasmin tPA）的共同受体. 根据三维图像研究分析，annexinⅡ蛋白表面呈环形盘状结构，3个Ca2+ 依赖的磷脂结合位点位于annexinⅡ表面凸区. 它含有3个基本的二肽序列，LysLys(79，80)，LysArg(203204)和LysArg(307308)，这3个肽段水解后均可产生羧基末端赖氨酸残基，是潜在的纤溶酶裂解位点. 其中，LysArg(307308) 最接近羧基末端，是最可能的纤溶酶靶点. PLG在AnnexinⅡ的激活，需借助受体羧基末端的裂解，进行受体修饰或受体“激活”作用. Mijung Kwon等人研究证明Annexin Ⅱ的异四聚体还具有还原血纤维蛋白溶酶的活性. 它可通过破坏纤溶酶原中的二硫键使其释放A61片段［11］. 四聚体中的Annexin Ⅱ亚基的Cys334残基和S100A10中的Cys61, Cys82均有还原酶活性.

　　2．5Annexin Ⅱ与骨组织Takahashi等［12］在研究中发现Annexin Ⅱ作为破骨细胞的表达产物通过自分泌或旁分泌作用于破骨细胞本身从而增强其形成能力并增强骨质的溶解. 在缺乏1，25（OH）2维生素D3的骨髓环境中Annexin Ⅱ增加了破骨细胞样的多核细胞数量并促进了骨的溶解.

　　新近研究表明［13］，Annexin Ⅱ在造骨细胞矿化过程中亦有一定作用. 研究人员通过在造骨细胞中高表达Annexin Ⅱ，使碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP)活性增强并伴有大量的造骨细胞矿化. Annexin Ⅱ和ALP的功能均与造骨细胞膜上的微小结构“脂筏”(即富含鞘糖脂和胆固醇的膜，能抵抗冷的Triton X100洗涤)密切相关. Annexin Ⅱ对ALP活性的促进有赖于胆固醇.

　　2．6Annexin Ⅱ与物质运输早期研究表明Annexin Ⅱ通过在胞内体及其他内涵体上形成网状结构，调节转运小泡的形成，参与胞吐过程，如嗜铬颗粒发生胞吐时其中可检测到Annexin Ⅱ. 一些蛋白的分泌，例如要与脂筏结构结合的蔗糖酶以及麦芽糖酶在向上皮细胞游离面运输时需要Annexin Ⅱ结合到运输小泡的膜上才能完成. 同时RNA干扰和抗体干扰的实验证明，Annexin Ⅱ参与依赖胰岛素的GLUT4的跨膜转运［14］. Annexin Ⅱ与钙离子通道形成相关. TPRV5和TPRV6是钙离子通道的受体，A2S100A10可与它们形成复合物影响钙离子内流. S100A10还可结合蓝舌病毒的NS3蛋白［15］. 通过这种结合，NS3蛋白可使聚集的病毒向胞外运输或在膜上定位. S100A10与NS3的结合位点恰恰与Annexin Ⅱ的结合位点相同，从而使A2S100A10形成受抑制，影响其生理功能.

　　2．7Annexin Ⅱ的分泌功能Annexin Ⅱ虽然缺乏经典的信号肽序列，但却能以某种不明机制转位于细胞膜表面.  例如Arunkumar B. Deora在加热刺激细胞的实验中，观察到Annexin Ⅱ转位于膜表面，并且这种转位依赖p11和酪氨酸磷酸化. 这说明除经典的内质网一高尔基复合体―细胞膜蛋白分泌途径以外还存在别的蛋白分泌途径. 前文提到Annexin Ⅱ在纤溶系统中的受体功能正是以Annexin Ⅱ分泌到胞外为基础的.
　　
　　有研究者通过用尼古丁刺激嗜铬细胞，观察到依赖外源性钙的Annexin Ⅱ分泌，并构建了一种可能的模型来阐明分泌机制. 该模型显示，Annexin Ⅱ介导嗜铬颗粒聚集后，颗粒接触面会出现空洞，甚至发生膜的破裂. Annexin Ⅱ被破裂的膜碎片包裹从而随着胞吐作用出胞，该过程如图4所示.

　　图4Faure等人提出膜结合表面多孔样模型，试图以此解释无信号肽引导的Annexin Ⅱ分泌［16］略

　　3Annexin Ⅱ与人类疾病的关系

　　3．1心血管疾病前已述之，A2S100A10四聚体与纤溶系统有密切关系，故在一些心血管疾病中可观察到Annexin Ⅱ的表达或功能异常. 在急性早幼粒细胞白血病（APL）中，Annexin Ⅱ异常高表达，促使纤溶酶过度产生引起异常纤溶亢进性出血［17］. 在动脉粥样硬化中，可能由于脂蛋白A的影响，Annexin Ⅱ的促纤溶作用减弱. 脂蛋白A含纤溶酶样载脂蛋白A，可结合低密度脂蛋白. 脂蛋白A抑制PLG结合到Annexin Ⅱ分子上，降低纤溶酶产生，导致纤维蛋白溶解障碍，促使进行性动脉粥样硬化发生. 另外同型半胱氨酸的含量增多会引起血管栓塞形成，这主要是由于同型半胱氨酸会竞争性抑制tPA和 Annexin Ⅱ的结合，从而减少纤溶酶产生，影响正常纤溶，使体内形成血栓.
 
　　3．2癌症 越来越多的研究表明，Annexin Ⅱ与癌症有着密切关系. 肿瘤细胞中可观察到Annexin Ⅱ表达增加从而激活纤溶酶原，导致肿瘤细胞易出血和转移能力增强从而出现癌变. 在多种类型的肿瘤中都可观察到Annexin Ⅱ的表达异常，如在胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、脑星型胶质细胞瘤、小细胞肺癌中表达上调，在食管癌、前列腺癌中表达下调等. 各类癌症中的表达异常各有不同的机制，有些作用机制还没有比较准确的解释. 比如食管鳞状细胞癌可能是由于Annexin Ⅱ通过对胞内钙离子的调控作用影响钙离子控制的细胞生长、角化、分化. AnnexinⅡ的mRNA和蛋白均在食管鳞癌组织中低表达，在中分化和低分化肿瘤中，蛋白表达明显低于高分化肿瘤. 所以AnnexinⅡ在食管鳞状细胞癌中的表达可能与鳞状细胞的分化程度有关［18］. 而在前列腺癌中观察到Annexin Ⅱ下调则是DNA甲基化引起的. 大多数癌症中可观察到的Annexin Ⅱ上调. 在胃癌细胞衍生出的细胞系中，观察到Annexin Ⅱ的高表达与cerbB2的高表达、分化、转移以及预后不良相伴［19］. Annexin Ⅱ和它的结合蛋白S100A10都可直接与胚癌抗原黏附分子1（CEACAM1）反应，这种上皮细胞黏附分子会在结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌中下调. 肺癌患者的呼吸道纤毛、胸膜间皮细胞以及I型、Ⅱ型肺泡上皮细胞上都有Annexin Ⅱ的高表达［20］. 它在肿瘤细胞表面与组织蛋白酶原C反应，促进细胞外蛋白溶解，易化肿瘤的浸润转移. 在肺癌患者血清中检测到了Annexin Ⅱ的自身抗体［21］，而以往的研究并未发现这种自身抗体在病理状况下有表达，这提示Annexin Ⅱ可能会与自身免疫疾病有关. 在胰腺癌细胞中，Annexin Ⅱ的高表达局限在表达增殖细胞核抗原PCNA的细胞内的，充分说明该蛋白与细胞增殖相关［22］. 较早的研究中将肝细胞癌中Annexin Ⅱ含量与正常肝脏、胚胎肝组织以及损伤后再生修复的鼠细胞中的含量作了对比，结果发现癌细胞中Annexin Ⅱ含量非常丰富.

　　3．3抗炎症作用Annexin Ⅱ的抗炎症作用主要体现在它对磷脂酶Ａ2（Phospholipase A2, PLA2）的抑制作用. 在炎症反应中，花生四烯酸(arachidonic acid, AA)会在PLA2作用下释放出来，后经环氧化酶途径和脂质氧化酶途径生成前列腺素和白三烯，以及通过其他途径生成的脂毒素等代谢产物，从而发挥炎症介质作用.  Annexin Ⅱ无论以单体还是以四聚体形式存在都可对PLA2活性产生抑制性作用，尤以四聚体抑制性作用更强. 有研究表明四聚体形式中的p11亚基具有比Annexin Ⅱ单体更强的抑制作用，所以四聚体形式的Annexin Ⅱ更能发挥抗炎症作用［23］. 同家族的Annexin I在抗炎症方面亦有很大作用.

　　3．4糖尿病研究糖尿病的实验中，Annexin Ⅰ, Annexin Ⅱ以及大量细胞骨架重建蛋白可与质膜结合形成葡萄糖加合物，这种糖基化作用会改变内皮细胞膜的流动性［24］. 另有研究表明在体外培养的大动脉内皮细胞表面，大量葡萄糖会诱导Hsp90与Annexin Ⅱ结合. Annexin Ⅱ在纤溶系统中生理功能会因这种变化无法正常发挥，从而引起糖尿病的并发症血栓形成，导致许多糖尿患者死亡［25］. 另外依赖胰岛素和肌动蛋白的转糖体GLUT4在脂肪细胞中的转运作用也需要Annexin Ⅱ辅助，若Annexin Ⅱ表达失调，会间接促进糖尿病及其各种并发症发生.

　　4

　　对Annexin Ⅱ的研究可追溯到20世纪80年代，二十年时间里，对该蛋白的认识不断更新. 对Annexins家族的病理研究进步显著以至于有了annexinopathies的概念［26］，这充分显示了该家族蛋白在机体中的重要地位. 但是仍有很多问题有待解决，例如，Annexin Ⅱ分泌的确切机制，它在癌症中究竟扮演了什么样的角色，是否可以提供新的药物靶点等都还需要深入细致的研究.

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