紫杉醇耐药的卵巢癌细胞中PKC

【关键词】  卵巢癌,紫杉醇耐药,P

　　Expressions of PKCα and Pgp   in Taxolresistant ovarian cancer cell line A2780/Taxol

　　【Abstract】  AIM:  To detect the expressions of Pglycoprotein （Pgp）and protein kinase Cα(PKC α) isoform in Taxolresistant ovarian  cancer cell line A2780/Taxol.  METHODS:  Immunohistochemical SP method and doublelabeled immunofluorescence were used to determine the expressions of Pgp and PKCα in A2780/Taxol and A2780.Western Blot was employed for assess Pgp expression after A2780/Taxol was cocultured with phorbol myristate acetate(PMA) or staurosporine (SP).  RESULTS:  There was a  coexpression of  Pgp and PKCα in  A2780/Taxol, but Pgp was not expressed in A2780.And the expression level of Pgp in A2780/Taxol was not affected by the presence of  PMA and SP. CONCLUSION:  Pgp and PKCα  play important roles in the resistance of ovarian cancer cell A2780  to taxol.

　　【Keywords】 ovarian neoplasms; Taxol  resistance, Pglycoprotein; protein kinase C

　　【摘要】目的： 探讨PKCα与Pgp在紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞系A2780/Taxol中的表达.  方法： 免疫细胞化学SP法及免疫荧光双标检测PKCα与Pgp在耐药细胞A2780/Taxol及其亲本细胞中的表达； Western Blot检测并半定量分析PKC激动剂佛波脂(PMA)和抑制剂十字孢碱(SP)作用后Pgp在两种细胞上的表达水平. 结果： 免疫细胞化学结果表明在A2780/Taxol中，Pgp与PKC表达均呈阳性，而在亲本细胞中，Pgp不表达，PKC呈阳性表达. 在A2780/Taxol中PKCα与Pgp有共表达. SP及PMA作用后，A2780/Taxol细胞Pgp表达无明显差别.  结论： 卵巢癌对紫杉醇耐药的产生与PKCα和Pgp有关.
 
　　【关键词】 卵巢癌，紫杉醇耐药，P糖蛋白，蛋白激酶C

　　0引言
 
　　紫杉醇在卵巢癌化疗中占有重要地位，而耐药是影响疗效的重要因素. 多药耐药基因(mdr1)编码的P糖蛋白(Pglycoprotein, Pgp)的过表达是紫杉醇耐药机制之一，而Pgp是由蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)磷酸化而发挥功能的，在PKC众多同功酶中又以α同功酶(PKCα)与多药耐药(multi drug resistence, MDR)关系最为密切. 因此我们培养紫杉醇诱导的卵巢癌耐药细胞，研究其Pgp及PKCα的表达，为逆转耐药提供依据.
 
　　1材料和方法

　　1.1材料卵巢癌细胞系 A2780及其紫杉醇耐药孕系(A2780/Taxol)由王泽华教授惠赠，培养于含有100 mL/L小牛血清的DMEM完全培养基，置于37℃， 50 mL/L CO2，相对湿度90% 的培养箱中培养；试剂 DMEM 购于Gibco公司，鼠抗人MDR1 mAb及兔抗人PKCα pAb购于Boster公司，SP免疫组化试剂盒，罗丹明标记的羊抗兔IgG及FITC标记的羊抗鼠IgG购于北京中山金桥生物技术公司，十字孢碱(SP)和佛波脂(PMA)购于Sigma公司.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞爬片A2780和A2780/Taxol细胞按2×106个/L浓度接种于装有防脱处理的盖玻片的6孔板中培养24 h，取出爬片，10  mol/L PBS冲洗2次，950 mL/L 乙醇固定10 min，中性树胶黏于载玻片上.

　　1.2.2免疫组化SP染色取上述细胞爬片，封闭后分别滴加鼠抗人MDR1  mAb(1∶50)和兔抗人PKCα pAb(1∶100), DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片.

　　1.2.3免疫荧光双染细胞爬片同上，滴加MDR1 mAb(1∶50)和兔抗人PKCα pAb(1∶100)，4℃冰箱孵育过夜，滴加FITC标记的羊抗鼠IgG和罗丹明标记的羊抗兔IgG，PBS振洗，甘油封片. 同时设PBS代替一抗的阴性对照.
 
　　1.2.4Western Blot实验分组1组： A2780细胞阴性对照组，2组：  A2780/Taxol细胞组；3组： A2780/Taxol细胞+PMA组： 培养A2780/Taxol细胞，PMA浓度200 nmol/L与细胞共同孵育40 min后收集细胞；4组A2780/Taxol细胞+SP组： 培养A2780/Taxol细胞，SP浓度100 nmol/L与细胞共同孵育2 h后收集细胞. 按［1］提取总蛋白，Lowry法定量，取20 μg蛋白样品进行SDSPAGE电泳，分离胶浓度7.5%，浓缩胶浓度5%，并电转移至硝酸纤维素膜上，用含10 mol/L BSA的TBST 4℃冰箱封闭过夜，加入兔抗人Pgp pAb（1∶500），室温轻摇60 min，加入羊抗兔APIgG,显色液避光显色2 min，同时，以βactin作内参. Western Blot结果以Image软件做图像弧度扫描，半定量采用与βactin的灰度比.
 
　　统计学处理： 以SPSS统计软件对结果进行统计分析，采用多样本snkq检验.

　　2结果

　　2.1Pgp在A2780/Taxol细胞中的表达免疫细胞化学SP染色结果表明Pgp在A2780/Taxol细胞中表达为阳性（图1），在A2780细胞中不表达；PKCα在两种细胞中均表达，在A2780/Taxol细胞中表达呈强阳性(图2)；免疫荧光双标结果示Pgp与PKCα在A2780/Taxol细胞中有共表达现象，在A2780细胞中仅有红色荧光，即仅有PKCα的表达（图3）.

　　图1－图3　略

　　2.2SP和PMA作用后Pgp在A2780/Taxol细胞中的表达A2780/Taxol组在Mr为170×103位置有明显条带. Western Blot半定量结果显示： A2780/Taxol组，A2780/Taxol+PMA, A2780/Taxol+SP组Pgp与βactin的灰度扫描值分别是28.93%， 29.34%, 28.57%，差异无统计学意义(P>0.05)，说明3,4组，与2组相比Pgp表达量并无明显增加或减少（图4）.

　　图4　略

　　3讨论

　　紫杉醇耐药的机制很多，目前比较确定的有Pgp表达的升高，微管β亚基的改变，微管α亚基的改变及凋亡途径改变. MDR1基因编码的Pgp是一种跨膜转运蛋白，具有ATP酶活性，能将化疗药物从细胞内泵出，降低细胞内的有效药物浓度而致多药耐药［2］. PKC是一种普遍存在的磷脂依赖性酶，与细胞增殖，分化，凋亡的信号转导息息相关, 也参与了多MDR形成过程的调控［3］. Gottesman等［4］在早期的研究中证明Pgp是由PKC磷酸化的，磷酸化后的Pgp活化而具有跨膜转运功能，并且这种磷酸化过程能够被verapamil抑制，而被PKC激活剂增强［5］，PMA就与PKC具有高亲和力,可以激活PKC. 而现已证实PKC存在至少11种不同亚型，它们都是由不同基因编码的功能相似的同功酶，广泛分布在各器官组织和细胞，它们在结构，生化性质，组织分布，亚细胞定位和底物特异性方面都有差别［6］. 韩英等［7］检测了PKCα,βⅠ在胃癌及其长春新碱耐药株中的表达，结果表明胃癌细胞SGC7901/ VCR 的耐药机制可能与PKCα有关,而与PKCβⅠ无明显相关性，相关实验还表明　PKC可能通过调节Pgp 的功能与表达而参与胃癌细胞多药耐药的形成. 这说明在PKC的众多亚型中，尤以α亚型与Pgp磷酸化关系最为密切［8］.
 　　
　　本实验我们采用Western Bolt检测Pgp的表达，结果显示A2780细胞表达呈阴性，而A2780/Taxol细胞中Pgp的表达呈阳性，表明卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药性产生与Pgp过表达有关. 该实验还通过免疫组化检测到在A2780/Taxol细胞中PKCα表达强于其在A2780细胞中的表达，这个结果说明Pgp通过PKCα活化而发挥功能，与上述理论相符，因此在免疫荧光双标实验中可以很清晰地看到Pgp与PKCα的共表达. 本试验我们还使用PKC激动剂PMA和抑制剂SP分别作用于A2780/Taxol细胞，通过Western Blot检测和半定量分析并未发现个组间Pgp表达有差别，这说明PKCα活性的增强或减弱在短时间作用后并不能使Pgp表达量增加.

　　然而，不同亚型同功酶在卵巢癌对紫杉醇耐药中起什么样的作用，对Pgp的表达和功能有什么影响，以及SP和PMA长时间作用后能否影响Pgp的表达量，还有待进一步实验. 这些研究将对卵巢癌患者的化疗具有重要意义.

　　【】

　　［1］ Sambiuok J, Fritsch EF, Maniatis T． 分子克隆［M］． 金冬雁，黎盂枫.  译． 2版． 北京： 出版社．1996:889-890.

　　［2］Aouali N, Eddabra L, Macadr J, et al. Immunosuppressors and reversion of multidrugresistance［J］.  Crit Rev oncal Heamato, 2005, 56(1):61-70.

　　［3］Kitazaki T, Oka M, Nakamura Y, et al. Gefitinib, an EGFR tyrosine kinase inhibitor,directly inhibits the function of Pglycoprotein in multidrug resistant cancer cells［J］.  Lung Cancer, 2005,49(3):337-343.

　　［4］ Gottesman MM,  Ling V. The molecular basis of multidrug resistance in cancer: The early years of Pglycoprotein research［J］. FEBS Lett, 2006,580(4):998-1009.

　　［5］ Minko T, Batrakova EV, Li s, et al. Pluronic block copolymers alter apoptotic signal transduction of doxorubicin in drugresistant cancer cells［J］.J Control Release, 2005,105(3):269-278.

　　［6］ Varma MV, Ashokraj Y, Dey CS, et al. Pglycoprotein inhibitors and their screening: A perspective from bioavailability enhancement［J］. Pharmacol Res,  2003,48(4):347359.

　　［7］ 韩英,时永全,郑悦,等. 胃癌耐药细胞系传统型蛋白激酶C的表达及活性［J］ . 第四军医大学学报, 2001,22(15):1358 -1361.

　　［8］ Hrycyna CA. Molecular genetic analysis and biochemical characterization of mammalian Pglycoproteins involved in multidrugresistance［J］.Semin Cell Dev Biol, 2001,12(3):247-256.