Endostatin抑制人卵巢癌细胞生长及其在裸鼠皮下移植瘤中的作用

                               作者：刘梅梅，隋丽华，李佩玲，程丽

【关键词】  抑制

　　【关键词】 卵巢癌；移植瘤；内皮抑素；Bcl2/Bax

　　0引言

　　我们采用人浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞系及其荷瘤鼠为研究对象，研究Endostatin对其增殖、凋亡的影响及作用机制，为其应用于卵巢癌的临床提供试验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　选用雌性6~8周龄BALB/c裸鼠10只，SPF条件下饲养. 人浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3由北京医科大学人民妇产科馈赠，用RPMI1640（含10 g/L小牛血清）培养基于37℃, 50 mL/L CO2条件下培养. Endostatin购自烟台麦得津生物工程公司，置于4℃保存. 抗Bcl2，抗Bax mAb及SP试剂盒购自北京中衫试剂公司.

　　1.2方法

　　1.2.1MTT法测定SKOV3细胞生长抑制率分组：PBS对照组（10 mmol/L PBS）和实验组（0.1，1.0，5.0，10.0和15.0 mg/L Endostatin）. SKOV3细胞以5×107/L密度接种于96孔板，每组设定6个平行孔，并设定空白对照. 细胞贴壁培养24 h后，分别加入上述不同浓度的药物，作用48 h后测定细胞A490值. Endostatin对卵巢癌细胞SKOV3生长的影响和抑制情况. 抑制率=（PBS对照组A490-药物组A490）/PBS对照组A490×100%.

　　1.2.2透射电镜下观察SKOV3细胞凋亡实验组SKOV3细胞作用不同时间（24，48和72 h）后，消化离心，用4℃，0.25 g/L戊二醛固定，0.1 g/L锇酸后固定，系列乙醇丙酮脱水，环氧树脂包埋，制成超薄切片，透射电镜下观察细胞凋亡形态.

　　1.2.3免疫细胞化学检测凋亡调控相关蛋白质表达的变化实验组SKOV3细胞爬片培养作用不同时间（24，48和72 h）后，丙酮室温固定10 min，进行免疫细胞化学SP法染色. 按说明书操作，DAB显色. 结果判定：以细胞核和细胞质呈明确的棕黄色为阳性染色.

　　1.2.4Endostatin对裸鼠肿瘤生长的影响

　　1.2.4.1裸鼠皮下瘤模型的建立已培养的SKOV3细胞，使细胞浓度达到5×1010/L，从裸鼠右肩胛部近腋窝处进针，每只裸鼠注射一点，约1×107个细胞. 观察接种部位有无渗出、肿瘤生长及裸鼠状况，待皮下瘤体积约100 mm×100 mm×100 mm时分组实验.

　　1.2.4.2Endostatin对卵巢肿瘤的治疗作用将裸鼠随机分成治疗组和对照组，每组5只. 实验组裸鼠每日皮下注射Endostatin 20 mg/kg，注射部位远离肿瘤形成部位，对照组以同样方法每日注射PBS. 每日测量肿瘤长度和宽度，计算肿瘤体积. 治疗21 d后将裸鼠处死，剥离出皮下肿瘤，备用.

　　1.2.5Endostatin对肿瘤组织中细胞凋亡的影响将切下的瘤组织置于0.25 g/L戊二醛中，4℃固定，电镜观察瘤组织中细胞形态的改变和观察细胞是否出现凋亡小体.

　　1.2.6Endostatin对瘤组织中Bcl2及Bax蛋白和mRNA表达的影响常规免疫组织化学法检测瘤组织中Bcl2及Bax蛋白的表达情况. 将切下的瘤组织置于液氮中，采用常规RTPCR方法观察Endostatin对Bcl2及Bax mRNA表达的影响. 引物由上海生物工程有限公司合成，序列引自［1］.

　　统计学处理： 数据均以x±s表示，采用Students t检验.

　　2结果

　　2.1Endostatin对SKOV3细胞生长的抑制作用不同浓度的Endostatin处理SKOV3细胞48 h后，与对照组相比，SKOV3的生长均受到不同程度的抑制. 比较A490值结果显示，细胞PBS对照组、0.1，1.0和5.0 mg/L Endostatin组之间差异无统计学意义（P>0.05），而10.0和15.0 mg/L Endostatin组的A490值分别与前4组比较，其差异有统计学意义（P<0.01）.

　　2.2Endostatin对SKOV3细胞凋亡的影响在透射电镜下观察，Endostatin处理SKOV3后，可见细胞皱缩，胞核固缩，细胞质内可见线粒体嵴絮状变，出现凋亡细胞，随Endostatin作用时间延长和剂量的增加，上述变化越来越明显(图1).

　　2.3Endostatin对SKOV3细胞凋亡调控相关蛋白表达的影响SKOV3细胞中Bcl2和Bax蛋白表达均定位于胞质和胞核. 与对照组相比，Endostatin处理后的SKOV3细胞中，Bcl2和Bax蛋白表达未见明显增强和减弱，并且在Endostatin作用时间和剂量上亦无明显相关性.

　　2.4Endostatin对裸鼠皮下移植SKOV3肿瘤生长的影响Endostatin组肿瘤生长缓慢，治疗15 d后，肿瘤体积明显小于对照组(P<0.05)，对肿瘤的最大抑制率可达到90.4%，但未发现Endostatin有明显的消瘤作用.

　　2.5Endostatin对裸鼠肿瘤组织中细胞凋亡的影响透射电镜下，Endostatin治疗组可见多个凋亡细胞，胞质可见完整的细胞器，细胞质浓缩或裂解成质膜包绕的碎片. PBS对照组未见明显凋亡细胞，但可见坏死细胞，细胞器结构多被破坏.

　　2.6Endostatin对裸鼠肿瘤组织中Bcl2及Bax蛋白和mRNA表达的影响

　　2.6.1免疫组织化学法Endostain治疗组肿瘤组织中Bcl2蛋白表达含量明显低于对照组，而Bax蛋白在两组中均有阳性表达，但其表达含量在两组间未见有明显的差异(图2).

　　2.6.2RTPCR法与PBS对照组相比，Endostatin下调裸鼠肿瘤组织中Bcl2 mRNA的表达，而对Bax mRNA的表达无明显影响(图3).
M：Marker DL2000；1,2,3： PBS对照组；4,5,6：Endostatin治疗组.
图3裸鼠肿瘤组织中Bcl2 mRNA的表达

　　3讨论

　　本研究结果提示，Endostatin具有抑制人卵巢癌细胞SKOV3增殖的作用. 但Endostatin抑制细胞增殖作用是否为内皮依赖性的，目前尚无定论. Endostaitn对鼠的移植实体瘤和霍奇金淋巴瘤具有明显的治疗作用［2］. 在鼠实验中，重组Endostatin可以抑制原发和继发瘤生长，且反复应用可以预防肿瘤复发［3］. 我们研究发现20 mg/kg剂量的人Endostatin可抑制裸鼠SKOV3卵巢癌移植瘤生长，抑制率达90.4%，但不具有明显消瘤作用. 有研究结果显示20 mg/kg的Endostatin可抑制肿瘤生长率达94.3%［2］. 这些结果差别可能是Endostatin蛋白产生来源不同、蛋白应用方式不同及不同肿瘤具有不同的生物特性所致. 我们采用了电镜的方法证实了一定浓度的Endostaitn可诱导SKOV3细胞凋亡. 但是在SKOV3细胞系中，未发现其对Bcl2和Bax表达含量有明显的调节作用. 在荷瘤鼠的体内实验中，Endostaitn治疗组的肿瘤组织中Bcl2的表达含量下调，而Bax表达含量仍然无明显变化. 由此推断，在卵巢癌SKOV3细胞系中，Endostaitn可能并不通过调节Bcl2/Bax表达含量而引发细胞的凋亡；而在卵巢癌组织中，Endostaitn能够促进细胞凋亡、抑制肿瘤生长，Bcl2/Bax表达含量比值的变化可能是其作用机制之一. 在卵巢癌细胞系和卵巢癌组织中Endostaitn作用机制的差异，可能存在着Endostaitn作用内皮细胞特异性方面的影响，但此结论尚需大样本的研究加以证实.

　　【】

　　［1］ Park WH, Seol JG, Kim ES, et al. Arsenic trioxide mediated growth inhibition in MC/CAR myeloma cells via cell cycle arrest in association with induction of cyclindependent kinase inhibitor, p21 and apoptosis［J］. Cancer Res,2000,60(11):3065-3071.

　　［2］ Bertolini F, Fusetti L, Mancuso P, et al. Endostatin, an antiangiogenic drug, induces tumor stabilization after chemotherapy or antiCD20 therapy in a NOD/SCID mouse model of human highgrade nonHodgkin lymphoma［J］. Blood, 2000, 96(1):282-287.

　　［3］ Vergani V, Garofalo A, Bani MR, et al. Inhibition of matrix metalloproteinases by overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinase2 inhibits the growth of experimental hemangiomas［J］. Int J Cancer, 2001,91(2):241-247.