CK20单克隆抗体的制备及鉴定

【关键词】  克隆

　　【关键词】 抗CK20单克隆抗体；SPASepharose；杂交瘤技术；Western Blot；ELISA

　　0引言

　　研究CK20表达用于诊断和评估膀胱肿瘤，已成为国内外研究热点之一. 但目前国内的抗CK20 mAb一直依赖进口，价格昂贵且不便运输，严重影响其推广应用和研究. 我们于2002年成功地从膀胱癌T24细胞系中提取CK20抗原［1］，我们采用CK20抗原通过杂交瘤技术制备抗CK20 mAb，为进一步研制CK20 mAb胶体金试剂盒筛查膀胱癌奠定基础.

　　1材料和方法

　　1．1材料

　　①动物及试剂  BALB/c小鼠购自第三军医大学动物中心，鼠龄6~12 wk，体质量18~22 g，雌雄不限；CK20抗原为本实验室纯化所得；Freund氏完全佐剂和不完全佐剂及HAT培养基为Gibco产品；SP2/0骨髓瘤细胞来自预防医学院病毒研究所；细胞融合剂PEG4000为Mereck产品，SPASepharose CL4B为Pharmacia产品；IgA, IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b及IgG3蛋白均为Sigma产品. ②仪器  国产96孔和24孔培养板、超净工作台；德国Heraeus离心机，BioRad公司550酶标仪、电泳仪、转膜系统及凝胶成像分析系统；德国LKB层析系统；Olympus倒置显微镜.

　　1.2方法

　　1.2．1动物免疫及脾细胞收集免疫方法参照［2］，共免疫3只小鼠，免疫后用琼脂扩散法检测小鼠血清产生抗体情况，选高效价者剪颈放血取脾，收集脾细胞，并作100 g/L台盼蓝染色，同时收集血液，分离血清供测定抗体滴度用.

　　1.2．2细胞融合及杂交瘤细胞选择性培养参照文献［2］进行，以HAT为培养液，滴加到已铺有饲养细胞96孔培养板中，置50 mL/L CO2培养箱中培养.

　　1.2．3阳性克隆筛选及克隆化培养以CK20抗原包被酶标板微孔，采用间接ELLSA法检测所有生长孔的培养上清液，并分别以小鼠多抗血清和PBS做阳性和阴性对照，经酶标仪测定A490 nm值，以等于或大于对照2.1倍为阳性. 阳性孔采用有限稀释法进行细胞克隆化. 克隆化培养1 wk后采用ELISA法检测有细胞克隆化生长的所有孔上清液，阳性者及时部分冻存，部分扩大培养. 待克隆长至孔底面积的1/3~2/1时，转至24孔扩大培养.

　　1.2．4杂交瘤细胞核型分析方法同外周血淋巴细胞染色体制作［3］，最后于油镜下计数20个分散较好且完整的中期分裂相.

　　1.2．5腹水抗体的制备及抗体含量测定共选择10只体健BALB/C小鼠，每只腹腔接种医用石蜡油0.5 mL，12 d后每只腹腔接种6×106个已克隆化细胞（约0.5 mL）. 2 wk后有明显腹水产生时剪颈处死，分别收集血液和腹水，1000 r×10 min，取上清，-20℃保存. 并采用Bradford assay法测定抗体含量.

　　1.2．6mAb纯化采用本实验室建立的方法纯化CK20 mAb［4］.

　　1.2．7mAb特性分析①mAb特异性鉴定  用Western Blot法，以纯化所得CK20 mAb作一抗与体外培养的膀胱肿瘤T24细胞行免疫印记试验，并以CK20抗原做对照. 将培养细胞裂解,离心,取上清用于SDSPAGE电泳,转膜后加CK20 mAb反应,显色,凝胶成像分析系统分析. ② mAb Ig类型及亚型鉴定  采用双向琼脂免疫扩散法［5］，将杂交瘤细胞培养上清液离心并浓缩10~20倍，加样于20 g/L琼脂中，分别加标准IgG, IgG1, IgG2a,IgG2b,IgA和IgM进行双向免疫扩散，将加样后琼脂板放入湿盒，置37℃水浴箱中24 h后观察结果. ③抗体效价检测  采用间接ELISA法，同时测定细胞培养上清液,免疫小鼠血清多抗,腹水mAb和纯化mAb效价.

　　2结果

　　通过测定被免疫小鼠的尾血发现，3只小鼠血清与CK20抗原均在琼脂管中相互扩散而形成一条抗原抗体结合线. 最后一次免疫72 h后，剪颈放血取脾，收集脾细胞，共获5×106脾细胞，台盼蓝染色后不着色细胞约占97%.  细胞融合后接种于2块96孔培养板中，共接种192孔，第15日时可见40孔有细胞生长，占20%. ELISA测定结果发现有8个阳性孔，占生长孔的20%. 取阳性克隆孔细胞株采用有限稀释法进行4次克隆化，每次接种60孔，其中有一株细胞（CK206）随着克隆次数增多，抗体阳性细胞生长孔从66%增至100%(表1)，选定细胞形态较好的细胞生长孔进行扩大培养和冻存，并命名为L20031030.表1杂交瘤细胞株克隆化结果(略)

　　小鼠脾脏淋巴细胞染色体众数为40，SP2/0为62~68，故杂交瘤细胞标记染色体众数应为99~108,本分析结果可见染色体众数为99~103，说明CK206细胞株是脾细胞和骨髓瘤细胞的融合体(图1).

　　Western Blot结果显示，纯化的CK20抗原及T24细胞裂解液均和CK206 mAb反应，在Mr为45.0×103附近显示出一条很浓的免疫印记带.说明CK206 mAb具有较高的特异性（图2）.

　　与IgG和IgG1之间形成一条沉淀线,故说明CK20 mAb属IgG1亚型.

　　三种成分的抗体效价分别是：培养上清液效价为1∶102，血清多抗效价为1∶103，腹水mAb和纯化mAb效价均为1∶106; 三个不同pH的0.1 mol/L枸橼酸洗脱时，分别收集20 mL；双向琼脂扩散法鉴定证实pH 6.0洗脱液为IgG1；Bradford assay法测定抗体浓度为1.44 g/L.

　　3讨论

　　膀胱肿瘤的诊断在临床上主要依靠膀胱镜加活检，其损伤性较大，患者难以接受. CK20在膀胱肿瘤细胞中具有独特的表达特性［6］，利用mAb可以通过免疫学法监测CK20表达来评价膀胱肿瘤，其特异性高，方法简单，结果较可靠. 我们于2002年纯化获得了CK20抗原，并进行了鉴定.杂交瘤技术是制备mAb传统而成熟方法，又不断得到改进. 我们根据本实验室经验和条件，结合试验具体情况对各个环节加以优化，如免疫剂量、方法和时间等，三只小鼠免疫后均产生了较强的抗体滴度，证实免疫是成功的.

　　细胞融合后要对融合效果进行鉴定，一般采用染色体分析. 本次分析结果可见杂交瘤标记染色体（众数为99~103），说明CK206细胞株是脾细胞和骨髓瘤细胞的融合体.

　　mAb的纯化方法较多,但最有效的方法尚属亲和色谱法，其方法效果好，回收率高达90％以上. 本研究我们利用SPA和Sepharose交联制成亲和层析柱，以不同的0.1 mol/L枸椽酸缓冲液为流动相，通过改变流动相pH值可将不同类型抗体逐级洗脱下来，如pH 6.0洗脱IgG1，pH 4.0洗脱IgG2a，pH 3.0洗脱IgG2b等，从对三组洗脱峰的鉴定来看，pH 6.0时所洗脱下来的抗体确是IgG1. 抗体纯化后要进行活性鉴定，从免疫印记结果看Mr为45.0×103附近出现一条很浓的抗原抗体杂交带，证明了CK206 mAb具有很强的特异性和活性.

　　　【】

　　［1］ 刘彦慧，罗春丽，吴小候，等.膀胱肿瘤T24细胞系中CK20纯化及鉴定［J］. 第三军医大学学报，2005，27（4）：302-305.

　　［2］ 王永杰，齐名，李保仝，等.抗克论特罗单克隆抗体杂交瘤的建立及其分泌单抗的免疫学特性鉴定［J］. 免疫学杂志，2004，20（3）：194-198.

　　［3］ 许艇，邵晓龙，秦治翔，等.杀虫剂西维因单克隆抗体的研制及鉴定［J］. 免疫学杂志，2004，20（1）：61-64.

　　［4］ 刘彦慧，罗春丽，吴小候，等. 细胞角蛋白单克隆抗体纯化方法的探讨［J］. 医学检验杂志,2005,6（1）:17-18.

　　［5］ 杨斌，何杨，赵益明，等. 抗人白细胞单克隆抗体的特异性及特异性鉴定［J］. 细胞与分子免疫学杂志，2002，18（2）：158-160.

　　［6］ 罗春丽，韩永华，吴小候，等. RTPCR检测膀胱移行细胞癌患者尿CK20mRNA表达研究［J］. 临床检验杂志，2004，22（2）:105-107.