人眼小梁组织及体外培养的人眼小梁细胞SPARC mRNA及其蛋白表达

【关键词】  人眼

　　Expression of SPARC mRNA and SPARC protein in human trabecular meshwork and cultured human trabecular meshwork cells in vitro

　　【Abstract】 AIM: To investigate whether secreted protein acidic rich in cysteine（SPARC) and SPARC mRNA are expressed in human trabecular meshwork（TM） and cultured human trabecular meshwork cells（TMCs） and to explore the roles of SPARC protein in the pathogenesis of primary openangle glaucoma (POAG). METHODS:  RTPCR and WesternBlot were used to detect SPARC mRNA and SPARC protein and immunofluorescence staining of cultured TMCs was performed by antiSPARC antibody. RESULTS:  RTPCR of TM and TMCs using SPARC specific primers of the RNA displayed the presence of the predicted band of approximately 300 bp. WesternBlot showed a protein band of 43 Ku. CONCLUSION:  Human TM and TMCs can express SPARC mRNA and its correlative protein, which influences the accumulation and degradation of extracellular matrix.

　　【Keywords】 trabecular meshwork；trabecular meshwork cells； secreted protein acidic rich in cysteine；extracellular matrix；primary openangle glaucoma

　　【摘要】 目的：研究人眼小梁组织（TM）及体外培养的人眼小梁细胞（TMCs）是否可以表达酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（SPARC) mRNA及SPARC蛋白. 探讨SPARC蛋白在原发性开角型青光眼（POAG）发病机制中的作用. 方法：分别采用RTPCR和WesternBlot方法，对小梁组织和细胞进行检测，用抗SPARC蛋白免疫荧光染色方法对细胞进行染色. 结果：组织和细胞RTPCR均在300 bp处出现预期的电泳条带，组织和细胞WesternBlot在Mr为43×103处出现蛋白条带. TMCs抗SPARC免疫荧光染色表现为胞质均匀着色. 结论：TM组织及体外培养的人眼TMCs均可表达SPARC mRNA及其相关蛋白，并起着调节细胞外基质（ECM）的生成和降解作用.

　　【关键词】 小梁组织；小梁细胞；酸性富含胱氨酸分泌型蛋白； 细胞外基质；原发性开角型青光眼

　　0引言

　　小梁网（trabecular meshwork, TM）临管区的邻管组织（juxta canalicular tissue, JCT）是形成房水流出阻力的重要部位，它是由小梁细胞（trabecular meshwork cells, TMCs）和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组成的无定型组织层. ECM在细胞外的表达处于持续的重塑状态. 其合成和降解是调节房水流出阻力的一个重要环节［1］. 研究表明酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（secreted protein acidic rich in cysteine，SPARC）在调节ECM的合成和降解中起着重要的作用. 它是一种细胞外基质相关糖蛋白的调节蛋白，又称为骨连蛋白，由3个结构域组成，Mr为43×103. 在多种组织中都发现了SPARC基因和其相关蛋白的表达，并起着调节细胞黏附、增殖、ECM的合成/转化以及ECM与细胞连接的作用［2］. 我们研究人眼TM组织和体外培养的人眼TMCs是否表达SPARC mRNA及其相应的SPARC蛋白，以进一步探讨改善房水流出、调节眼压（intraocular pressure, IOP）的机制以及原发性开角型青光眼（primary openangle glaucoma, POAG）的发病机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　DMEM培养基、Trizol总RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒、Taq酶均购自Gibico公司;BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司）；羊抗人SPARC pAb（Santa Gruz公司）；荧光素标记的兔抗山羊IgG（华美技术有限公司）. 人眼TM组织来自角膜移植供眼，皆为死后12 h以内剥离的TM组织，分别用于细胞培养及组织SPARC mRNA提取、RTPCR及SPARC蛋白WesternBlot检测.

　　1.2方法

　　1.2.1人眼TMCs体外培养行人眼TMCs体外培养组织学鉴定［3］，取传3代生长良好细胞用于实验.

　　1.2.2组织和细胞总mRNA提取取0.1 g TM组织，加1 mL TRIzol，匀浆，加氯仿、异丙醇沉淀RNA，离心，加DEPC水配制的乙醇， -20℃保存，选用A260 nm/A280 nm值近似2.0者用于RT反应. 细胞mRNA提取：冰上收集传3代TMCs（每份样品约3×106个细胞），加入1 mL TRIzol，注射器内反复抽提，其余同组织mRNA提取.

　　1.2.3组织和细胞SPARC mRNA RTPCR分析

　　1.2.3.1引物设计［4］的方法，扩增长度300 bp，内参照采用βactin，扩增长度451 bp.

　　1.2.3.2逆转录反应cDNA合成采用20 μL反应体系， 42℃温育15 min,99℃加热5 min,5℃ 5 min终止反应.

　　1.2.3.3RCR扩增采用20 μL反应体系. PCR方案：94℃预变性5 min，94℃变性60 s, 50℃退火60 s, 72℃延伸60 s,共35个循环.

　　1.2.3.4产物鉴定取5 μL PCR反应产物, 15 g/kg琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外灯下观察有无特异性条带.

　　1.2.4TM组织及TMCs SPARC蛋白WesternBlot分析分别取TM组织和传3代TMCs，加入膜蛋白裂解液，匀浆，离心，收集沉淀, -70℃保存待用. 稀释并定量细胞和组织蛋白样品，取样品50 μL，行SDSPAGE变性电泳，考马斯亮兰染色. PVDF转膜，脱脂牛奶封闭，依次加入第一抗体（羊抗人SPARC pAb，1∶500）、第二抗体（辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG，1∶500），DAB显色，扫描图像.

　　1.2.5免疫荧光细胞染色取生长于盖玻片的传3代人眼TMCs，固定，分别加一抗（山羊抗人antiSPARC IgG）及荧光素标记二抗（兔抗羊mAb）行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察细胞内SPARC表达. 采用PBS代替一抗孵育细胞，作为阴性对照.

　　2结果

　　2.1人眼TMCs培养TM组织贴壁后7～14 d即有细胞自边缘爬出，倒置显微镜下观察细胞成多角型、梭型，融合后为介于内皮与上皮细胞中间形态的扁椭圆形，透射电镜下可见胞体表面有突起及微绒毛，细胞器丰富，抗NSE、抗vimentin染色阳性，抗VIIIAg染色阴性.

　　2.2组织及细胞SPARC mRNA RTPCRPCR扩增35个循环所获产物电泳的结果可见βactin在451 bp处明显表达，TM组织和体外培养的人眼TMCs均可表达SPARC mRNA，在300 bp位置出现电泳条带（图1）.

　　2.3组织及细胞SPARC蛋白WesternBlot检测TM组织和体外培养的人眼TMCs均可表达SPARC蛋白，在Mr为43×103处出现明显蛋白条带，与纯SPARC蛋白电泳位置相同（图2）.

　　2.4TMCs抗SPARC免疫荧光染色抗SPARC染色呈阳性，可见胞质均匀荧光分布（图3），以PBS代替一抗的对照组胞质内无荧光显示.

　　3讨论

　　POAG的发病机制仍不清楚. 近年来研究表明TM组织，尤其是临管区ECM的异常堆积造成的房水引流阻力的增加，在POAG的发病中起着重要的作用. 前房灌注的方法发现黏多糖降解酶和基质金属蛋白酶（MMPs）能够显著降解ECM，从而产生调节IOP的作用. 骨连蛋白/SPARC是一种Mr为43×103分泌型糖蛋白，包括了血小板反应蛋白1和2，tenascins C和骨桥蛋白. SPARC在体内的两个基本功能为抗黏附和抗增殖作用. 原位杂交和免疫组化的研究表明很多种组织在重塑、正常发育和损伤修复过程中出现高水平的SPARC mRNA和SPARC蛋白的表达. 在眼部研究发现体外培养的角膜细胞能够表达SPARC mRNA,并合成相应的SPARC蛋白. 在角膜基质损伤和修复过程中SPARC合成和沉积增加，并将此作为角膜损伤修复的一个标志［5］. SPARC敲除的裸鼠表现为早期发生晶体浑浊，成熟迟缓，说明SPARC是维持正常发育和晶体透明的重要因素［6］. SPARC在对细胞及ECM的调节过程中表现为①抑制细胞伸展，松解局部连接，特别是ECM与细胞骨架中的肌动蛋白相连接的位点；②通过调节血浆纤溶酶原激活物抑制剂（PAI1）、纤维连接蛋白、层黏蛋白、血小板反应蛋白1的水平而刺激MMP1，2，9的生成，产生降解组织基底膜和ECM的作用. 但是SPARC mRNA及其相应蛋白在TM组织及TMCs是否有表达，以及相关的调节因素?  本实验结果显示TM组织和体外培养的TMCs均可表达SPARC mRNA，表现为在300 bp处出现一明显的mRNA 电泳带. 同时在TM组织和体外培养的TMCs中该mRNA可表达出相应的蛋白，WesternBlot检测发现在Mr为43×103处出现蛋白条带，这与Golembieski等［7］对SPARC的研究相符. 说明SPARC mRNA及其相应蛋白影响着TM组织临管区ECM的生成和降解，进而产生对房水流出及眼压IOP的调节. 我们实验中的人眼TM组织取自角膜移植供眼，供体年龄为30岁，因此无法得知SPARC的表达随年龄变化的改变情况. 已知ECM在TM 的堆积与年龄的增长有关，因此推测随年龄的增长SPARC的表达很可能会出现下调，而SPARC功能的改变会继发ECM代谢的异常，进而导致IOP升高. 但是在POAG时SPARC的表达是上调还是下调，程度如何，以及什么干预因子能够影响到其表达方面还需进一步研究.

　　【】

　　［1］ Bradley JM, Vranka J. Effect of matrix metalloproteinases activity on outflow in perfused human organ culture［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998,39(13):2649-2658.

　　［2］ Brekken RA, Puolakkainen P, Graves DC, et al. Enhanced growth of tumors in SPARC null mice is associated with changes in the ECM［J］. J Clin Invest，2003, 111(4): 487-495.

　　［3］ 张文强，杨新光，郭斌，等. 压力对体外培养牛眼小梁细胞的影响［J］. 第四军医大学学报，2003,24(9):802-804.

　　［4］ Bradshaw AD, Sage  EH.Expression and purification of recombinant human SPARC produced by baculovirus［J］. Mol Cell Biol Res Commun， 2000, 3(6): 345-351.

　　［5］ Abe K, Hibino T, Mishima H, et al. The cytokine regulation of SPARC production by rabbit corneal epithelial cells and fibroblasts in vitro［J］. Cornea, 2004,23(2):172-179.

　　［6］ Sawhney RS. Expression and regulation of SPARC, fibronectin, and collagen IV by dexamethasone in lens epithelial cells［J］. Cell Biol Int， 2002,26(11): 971-983.

　　［7］ Golembieski WA, Rempel SA. cDNA array analysis of SPARCmodulated changes in glioma gene expression［J］. J Neurooncol， 2002,60(3):213-226.