染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌细胞SKOV
作者：袁鹏，黄艳红，辛晓燕，宋晖，田爽，王德堂
【关键词】 染料
bined with cisplatin on drugresistant ovarian carcinoma cell SKOV3
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of genistein combined with cisplatin on the proliferation and apoptosis of drugresistant ovarian carcinoma cell SKOV3. METHODS: The growth inhibitory effect of genistein and cisplatin on SKOV3 cells was studied by MTT growth assay, the morphological alterations of SKOV3 cells were demonstrated by Hoechst 33342 staining under a fluorescence microscope and apoptosis and cell cycle distribution were detected by flow cytometry. RESULTS: Various concentrations of genistein in combination with cisplatin resulted in the reduction of IC50 by 32.3%-79.8% in SKOV3 cells. The combination index of genistein and cisplatin in SKOV3 cells ranged from 0.586 to 0.869, which indicated that they acted in a slightly to highly synergistic pattern. The apoptotic rate was also significantly raised by combination of genistein and cisplatin, which showed a relationship with G2/M arrest and the disturbance of S phase because there was a negative correlation between apoptotic rate and G1 phase cell fraction（rs=-0.953, P<0.05）. CONCLUSION: Genistein can significantly improve the growth inhibition and cytotoxicity effects of cisplatin on SKOV3 cells and the two agents act in a synergistic way. These synergistic effects may be related to the G2/M arrest and the disturbance of S phase by genistein.
【Keywords】 genistein; cisplatin; ovarian neoplasms; drug synergism
【摘要】 目的：探讨染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌细胞系SKOV3增殖与凋亡的影响. 方法：采用MTT比色法检测染料木黄酮和顺铂联用对SKOV3细胞增殖的影响，Hoechst染色荧光显微镜下观察联合用药后细胞形态的改变，流式细胞仪分析细胞周期并检测凋亡率. 结果：联用不同浓度的染料木黄酮后顺铂对SKOV3细胞IC50降低率为32.3%~79.8%,两药联合作用系数在0.586~0.869之间，为轻度至高度协同作用. 染料木黄酮与顺铂联用可显著提高凋亡率，两药联用诱导SKOV3细胞凋亡和阻滞G2/M期、干扰S期进程，凋亡率与G1期细胞比例呈负相关（rs=-0.953, P<0.05）. 结论: 染料木黄酮可以增强顺铂对SKOV3细胞的增殖抑制作用和杀伤作用，两种药物具有协同作用. 染料木黄酮阻滞细胞于G2/M期并同时干扰S期进程可能是两药发挥协同作用的重要机制.
【关键词】 染料木黄酮；顺铂；卵巢肿瘤；药物协同作用
0引言
近年来染料木黄酮（4，5，7三羟基异黄酮，genistein）对肿瘤生长的抑制作用日益受到重视，尤其是它可以增强常规化疗药物的疗效［1-2］. 而染料木黄酮和传统化疗药物顺铂联用能否增强顺铂对耐药卵巢癌的杀伤作用呢？为此，我们研究了染料木黄酮与顺铂联用对耐药卵巢癌SKOV3细胞增殖与凋亡的影响及其机制.
1材料和方法
1.1材料
人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3由西京妇产科实验室保存，该细胞系对顺铂等多种药物耐药；RPMI 1640培养基(Gibco公司)；新生牛血清(四季青公司)；顺铂(齐鲁制药厂)；染料木黄酮、二甲基亚砜（DMSO）,Hoechst33342(Sigma公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Amresco公司). 细胞周期检测试剂盒为DNAPrep Stain kit(BeckmanCoulter公司)；Wellscan MK3型全自动酶标仪(Labsystems Dragon公司)；ELITE ESP型流式细胞仪（BeckmanCoulter公司）.
1.2方法
1.2.1MTT法检测细胞增殖抑制率取对数生长期的SKOV3细胞，8×103个/孔接种于96孔培养板，置37℃，50 mL/L CO2培养箱培养12 h，细胞贴壁后弃去培养液，然后加入含不同浓度药物的培养基200 μL：对照组只加RPMI 1640培养基(100 mL/L小牛血清)；顺铂组加入顺铂浓度分别为0.625，1.25，2.5，5，10，20 mg/L的培养基；染料木黄酮组加入染料木黄酮浓度分别为2.5，5，10，20，30，40，50 mg/L的培养基；染料木黄酮和顺铂联用组为2.5，5，10，20 mg/L的染料木黄酮与顺铂联用，顺铂浓度同单药组，每组均设6个复孔. 继续培养至加药后96 h，每孔加入MTT(5 g/L,20 μL),继续孵育4 h后弃培养液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，用酶标仪检测各孔吸光值(A490 nm)，按以下公式：细胞增殖抑制率=（对照组A490 nm-实验组A490 nm）/对照组A490 nm×100%，取6复孔均值绘制抑制率与药物剂量关系曲线，按作图法求出半数抑制浓度（IC50）. 同时采用联合作用指数(combined index，CI)判断染料木黄酮和顺铂联用的性质. CI=DA／ICX,A+DB／ICX,B (A，B代表两种不同药物，ICX,A和ICX,B是两种药物单独使用使生长抑制率达X时的药物浓度，DA和DB是两药联用使生长抑制率达X时两种药物的浓度)［3］. 根据Soriano等［4］的判断方法，0.9≤CI≤1.1为叠加作用，0.8≤CI<0.9为低度协同作用，0.6≤CI<0.8为中度协同作用，0.4≤CI<0.6为高度协同作用，0.2≤CI<0.4为强协同作用.
1.2.2荧光染色观察细胞形态的改变接种SKOV3细胞于盖玻片，置于六孔板内，细胞贴壁后加入不同药物，根据MTT结果分为4组：即对照，顺铂（2.5 mg/L），染料木黄酮（10 mg/L）和染料木黄酮（10 mg/L）+顺铂（2.5 mg/L）. 继续培养36 h，固定后加入0.5 mL Hoechst33342（10 mg/L），染色15 min后弃染液清洗，抗荧光淬灭液封片，紫外光激发，在荧光显微镜下观察.
1.2.3流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化收集SKOV3细胞，调整细胞密度为5×107/L，以每瓶8 mL接种于75 mL培养瓶，细胞贴壁后弃去培养液，加入含不同浓度药物的培养基. 根据MTT结果，顺铂浓度选2.5 mg/L, 染料木黄酮浓度选5和10 mg/L，设对照、单药和联用共6组. 加药36 h后收集细胞，分别按DNAPrep Stain Kit试剂盒和Apoptosis Detection Kit试剂盒说明书进行细胞固定、染色，上流式细胞仪分析.
统计学处理： SPSS 11.0软件进行秩相关分析.
2结果
2.1染料木黄酮与顺铂联用对SKOV3细胞增殖的影响染料木黄酮、顺铂单药的IC50分别为30.0 mg/L和9.9 mg/L，4种不同浓度的染料木黄酮与顺铂联用后顺铂的IC50明显降低，与单用顺铂组比较，4种不同浓度的染料木黄酮可使顺铂的IC50分别降低到6.7，4.2，2.5和2.0 mg/L（图1）. 当达到半数抑制时，不同浓度组合的染料木黄酮与顺铂的CI分别为0.760，0.591，0.586，0.869. 其中10和5 mg/L染料木黄酮与顺铂联用达到高度协同作用；20.0 mg/L和2.5 mg/L染料木黄酮与顺铂联用分别达到低、中度协同作用.
2.2染料木黄酮与顺铂联用后SKOV3细胞形态的改变对照组细胞核均匀淡染，界限清楚，呈正常结构(图2A)；顺铂组与对照组无明显差异(图2B)；染料木黄酮组可见少量凋亡细胞(图2C)；联用组出现大量典型的凋亡细胞：细胞核染色明显增强，荧光更为明亮，强度深浅不一，并可见浓染致密的染色质凝集，呈颗粒状、固缩状或团块状结构（图2D）.
2.3染料木黄酮、顺铂单药及联用对SKOV3细胞周期及细胞凋亡的影响对照组绝大多数细胞处于DNA合成前期，G1期细胞比例高，S期和G2期细胞较少，凋亡率很低；2.5 mg/L顺铂组对SKOV3细胞周期和凋亡率无明显影响；5和10 mg/L染料木黄酮组均成倍升高G2/M期细胞比例并增加凋亡率，10 mg/L染料木黄酮还进一步的升高了S期细胞比例；2.5 mg/L顺铂+5 mg/L染料木黄酮和2.5 mg/L顺铂+10 mg/L染料木黄酮组可使G2/M期阻滞和细胞凋亡得到显著加强. 各组SKOV3细胞G1期比例随着不同浓度染料木黄酮与顺铂的处理而改变，经直线相关分析，表明细胞凋亡和G1期细胞比例呈负相关（rs=-0.953, P<0.05），与G2/M期+S期的细胞比例成正相关（表1）.表1不同浓度染料木黄酮与顺铂诱导的SKOV3细胞周期和凋亡率的改变(略)
3讨论
铂类药物是卵巢癌联合化疗方案中最常用的药物，而卵巢癌对铂类药物的耐药性及其毒副作用常常导致化疗方案难以奏效. 近年来研究表明染料木黄酮具有抑制肿瘤细胞生长、促进凋亡的作用，可以增强前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤细胞对化疗的敏感性，提高化疗的效果，而且可以在不降低疗效的前提下减少化疗药物用量，从而减轻化疗的毒副反应［1-2］. 那么染料木黄酮能否增强传统化疗药物顺铂对耐药卵巢癌的疗效呢？在实验中我们发现SKOV3细胞明显对顺铂耐药，其IC50达到9.9 mg/L，远远超出顺铂的血浆峰值浓度（2.5 mg/L），而染料木黄酮与顺铂联用时则表现出不同程度的协同作用，可明显降低顺铂对SKOV3细胞的IC50，10 mg/L浓度以上的染料木黄酮可将顺铂对SKOV3细胞的IC50降至血浆峰值浓度以下，两药联用也显著的提高了凋亡率. 采用荧光显微镜观察细胞形态，也可以发现血浆峰值浓度的顺铂对SKOV3细胞几乎没有什么影响，而与染料木黄酮联用时可诱导出大量凋亡.
流式细胞术结果提示周期阻滞和细胞凋亡是染料木黄酮与顺铂发挥协同作用的重要机制，而且两药协同诱导细胞凋亡与周期阻滞是有联系的. 凋亡率与G1期比例呈负相关, 间接的表明染料木黄酮与顺铂联用诱导凋亡和阻滞G2/M期和干扰S期进程有关. 染料木黄酮可将SKOV3细胞阻滞于G2/M期，并诱导一定程度的细胞凋亡，而G2/M期正是顺铂诱导凋亡的重要时期［5］，两者在这方面的一致性可能是它们发挥协同作用的基础. 在我们的结果中，10 mg/L 染料木黄酮可进一步地将一部分细胞阻滞于S期. 实验中发现5，10 mg/L染料木黄酮联合顺铂作用时，G2/M期细胞比例相近，但凋亡率却差别甚远，提示两种浓度的染料木黄酮对S期干扰程度的不同可能是造成凋亡率差异的原因. S期即DNA合成期，核苷酸双链在S期分离，对外界环境非常敏感，更易于被肿瘤化疗药物所杀伤，干扰S期进程理论上应该会增加凋亡率. Kolfschoten等［6］采用顺铂加阿霉素化疗方案15例包含不同组织学类型的卵巢癌移植瘤裸鼠，发现顺铂不敏感裸鼠S期肿瘤细胞比例较低，而S期肿瘤细胞比例较高的裸鼠对顺铂敏感性较强，顺铂敏感性与S期细胞比例成正相关. 高浓度的染料木黄酮可干扰S期进程可能是其与顺铂发挥协同作用的另外一个重要机制.
我们的研究表明，染料木黄酮和顺铂可协同抑制耐药卵巢癌细胞SKOV3的增殖、促进其凋亡，这对强化常规化疗的效果、减轻化疗的毒副作用是非常有意义的. 其作用机制可能与染料木黄酮干扰细胞周期，从而增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性有关. 染料木黄酮增强顺铂对耐药卵巢癌细胞SKOV3的杀伤作用的分子机制还有待探讨.
【】
［1］ Li Y, Ahmed F, Ali S, et al. Inactivation of nuclear factor kappaB by soy isoflavone genistein contributes to increased apoptosis induced by chemotherapeutic agents in human cancer cells［J］. Cancer Res，2005,65(15):6934-6942.
［2］ Li Y, Ellis KL, Ali S, et al. Apoptosisinducing effect of chemotherapeutic agents is potentiated by soy isoflavone genistein, a natural inhibitor of NFkappaB in BxPC3 pancreatic cancer cell line［J］. Pancreas，2004,28(4):e90-e95.
［3］ 李也鹏,胡成平,吴鄂生. NS398和顺铂联用对人肺腺癌增殖的影响及其机制初步探讨［J］. 肺癌杂志，2005,8(1):8-13.
［4］ Soriano AF, Helfrich B, Chan DC,et al. Synergistic effects of new chemopreventive agents and conventional cytotoxic agents against human lung cancer cell lines［J］. Cancer Res， 1999,59(24):6178-6184.
［5］ Bose RN. Biomolecular targets for platinum antitumor drugs［J］. Mini Rev Med Chem，2002,2(2):103-111.
［6］ Kolfschoten GM, Hulscher TM, Pinedo HM, et al.Drug resistance features and Sphase fraction as possible determinants for drug response in a panel of human ovarian cancer xenografts［J］. Br J Cancer，2000,83(7):921-927.
