血管性痴呆小鼠海马NOS活力和nNOS蛋白表达的改变

【关键词】  血管

　　Changes of NOS activity and nNOS expression in hippocampus of vascular dementia mice

　　【Abstract】 AIM: To observe the activity changes of nitric oxide synthase (NOS) and the expression level of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in the hippocampus of vascular dementia (VD) mice and to investigate the mechanism underlying VD. METHODS:  Models of VD mice were made. NADPHd histochemistry and nNOS immunohistochemistry were used to investigate the changes of NOS in different groups and Ymaze test was conducted to observe the changes of their learning and memory abilities. RESULTS:  Compared with those of the control group, the learning and memory abilities of the VD group significantly decreased (P<0.01) and the number of NOS positive neurons and nNOS positive neurons in the hippocampus significantly increased (P<0.05). CONCLUSION:  VD is probably related to the increase of the numbers of NOS positive neurons and nNOS positive neurons in the hippocampus.

　　【Keywords】 dementia, vascular ; hippocampus; neuronal nitric oxide synthase; nitric oxide synthase

　　【摘要】 目的： 观察血管性痴呆(VD)小鼠海马内一氧化氮合酶（NOS）的活性和神经元型一氧化氮合酶（nNOS）阳性神经元的表达，探讨VD的发生机制. 方法： 复制小鼠VD模型，利用Y迷宫检测VD模型小鼠学习记忆能力，采用NADPHd组织化学和nNOS免疫组织化学方法，研究VD小鼠与正常小鼠海马NOS和nNOS阳性神经元数量的变化. 结果： VD小鼠比正常小鼠Y迷宫学习记忆训练次数明显增多，差异有显著性（P<0.01）；海马CA1区NOS和 nNOS阳性神经元的数量明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）. 结论： VD的发生可能与海马NOS和 nNOS阳性神经元的数量增多有关.
 
　　【关键词】 痴呆，血管性；海马；神经元型一氧化氮合酶；一氧化氮合酶

　　0引言
　　
　　自20世纪80年代发现内源性一氧化氮（nitric oxide,  NO）以来，其复杂的生理及病理作用已引起人们的广泛重视. NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化L精氨酸而生成，NOS在脑缺氧缺血中的双重作用已日益受到重视. 我们采用组织化学和免疫组织化学的方法，探讨(vascular dementia, VD)小鼠海马结构内NOS和nNOS阳性神经元数目的变化以期揭示VD的发生机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　成年健康昆明系雄性小鼠共36只（购自天津市实验动物中心），体质量(30±3) g，随机等分为3组： 正常对照组、假手术组、VD模型组（n=12）.
 
　　1.2方法

　　1.2.1小鼠VD模型的制备室温18～22℃，将小鼠称质量后用4 g/L戊巴比妥钠（10 mL/kg, ip）麻醉后，仰卧固定在手术台上，颈正中切口，手术分离双侧颈总动脉（common carotid arteries, CCA）穿线备用，模型组在夹闭双侧CCA之前，腹腔注射硝普钠（2.5 mg/kg），随即用无创动脉夹夹闭双侧CCA  10 min，通10 min,再夹闭10 min,再通后缝合伤口，放回笼中保温饲养［1］. 假手术组麻醉及手术方法与模型组相同，但仅暴露双侧CCA，不阻断CCA,不注射硝普钠，观察时间与模型组相同.

　　1.2.2学习记忆能力的测定造模后7 d，根据小鼠既怕光刺激又怕电刺激的本性，开始Y迷宫行为学测试. Y迷宫分为三臂，臂与臂之间角度为120°. 在每支臂内，有光刺激时无电刺激，无光刺激时有电刺激，迷宫实验时，三臂中两臂有电刺激而无光刺激，一臂有光刺激而无电刺激. 将动物放入迷宫的一臂（有光、无电）适应60 s后切换光源（无光源的两臂及三臂连接处有电），待动物进入有光无电处后开始记时，30 s时切换光源. 如此进行切换20次，每次切换光源都使动物学习1次，每日每只动物最多如此学习20次，第20次切换后待动物进入有光无电处后适应30 s将动物取出. 每只动物连续9次从无光有电处直接进入有光无电处为学会，第1日学不会者第2日继续学习，直至学会. 将学会次数进行统计学分析.

　　1.2.3组织的制备各组小鼠经4 g/L戊巴比妥纳（10 mL/kg, ip）麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针至左心室，并剪开右心耳形成灌注液排出通道，从左心室快速灌注温生理盐水，至流出液清亮，此时接着灌入4℃的40 g/L多聚甲醛，30~40 min灌毕，迅速取脑置于4℃的40 g/L多聚甲醛固定液中后固定6 h，100, 200和300 g/L蔗糖溶液梯度脱水. 将大脑沿矢状面切开，将左侧大脑半球置于恒冷箱冰冻切片机内做连续冠状冰冻切片，片厚约50 μm, 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）接片后进行NADPHd组化染色和nNOS免疫组化染色.

 
　　1.2.4NADPHd组化染色切片移入NADPHd反应液，37℃孵育1 h，反应液成分： NADPHⅡ（Sigma公司）5 mg， NTB(氯化硝基四氮唑蓝，华美公司)2.5 mg, 3 mL/L的TritonTBS 5 mL. 终止反应后裱片，脱水，透明，封片.

　　1.2.5免疫组化反应切片移入37℃ 3 mL/L的TritonH2O2中孵育30 min, PBS缓冲液漂洗后以30 mL/L的正常羊血清封闭30 min，然后加nNOS抗体（1∶200, Santa Cruz公司），4℃温盒内孵育72 h. 漂洗后加生物素标记的兔抗羊血清（1∶200），37℃孵育1 h，漂洗后ABC液（1∶100, Vector公司）37℃孵育1 h，漂洗后加0.5 mL/L的DAB和0.1 mL/L的H2O2显色，镜下控制反应时间5~10 min，常规裱片，脱水，透明，封片.

　　1.2.6计数方法选取每只小鼠对应断面的背侧海马脑片2张置于PBS缓冲液中，每组共选取脑片24张, 分别计数海马结构CA1, CA3,齿状回（DG）三区所有NOS和nNOS阳性细胞数.

　　统计学处理： 利用SPSS11.0统计软件对数据进行统计学分析，结果以x±s表示，经方差齐性检验，表1方差不齐，采用多个样本的秩和检验，表2和表3方差齐，组间差异比较采用单因素方差分析和两两比较的q检验.

　　2结果

　　2.1VD小鼠行为学测试与正常对照组和假手术组相比，VD模型组小鼠Y迷宫学习记忆次数明显增加，差异显著［(134±41) vs (43±14)和（47±10）， P<0.01］；而正常对照组与假手术组相比，差异无统计学意义； VD模型组小鼠学习记忆能力明显降低.

　　2.2VD模型组小鼠海马各区NADPHd阳性神经元数量的变化与正常对照组和假手术组相比，VD模型组小鼠海马及其CA1区NADPHd阳性神经元数量明显增多，差异有统计学意义（P<0.01），CA3区和DG无明显差别；而正常对照组与假手术组相比，海马各区神经元数量均无统计学差异，说明VD模型组小鼠海马及其CA1区NOS阳性神经元数量明显增多（表1, 图1).表1VD小鼠海马及其各分区的NOS阳性神经元数量（略）

　　2.3VD模型组小鼠海马各区nNOS阳性神经元数量的变化与正常对照组和假手术组相比，VD模型组小鼠海马及其CA1区nNOS阳性神经元数量明显增多，差异有统计学意义（P<0.01），CA3区和DG无明显差别；而正常对照组与假手术组相比，海马各区神经元数量均无统计学差别； VD模型组小鼠海马及其CA1区nNOS阳性神经元数量明显增多（表2, 图2).表2VD小鼠海马及其各分区nNOS阳性神经元数量（略）

　　3讨论

　　目前常用于VD研究的动物模型主要有四血管阻断（4VO）法和两血管阻断（2VO）法. 有报道表明，较严重的不完全性脑缺血动物大脑损伤较相同时间完全脑缺血的动物恢复差. 因此本研究采用王蕊等［1］的VD模型方法制作动物模型.

　　NO性质活泼，半衰期极短，在体内生物半衰期仅数秒钟，故NO的作用与NOS水平密切相关，对NOS蛋白表达变化的研究是对NO进行深入探讨的重要环节. NOS有3种类型，分别为nNOS, eNOS 和iNOS，其中nNOS产生的NO可致脑缺氧缺血的早期脑损伤. NO作为细胞内信使参与长时程增强（LTP）的诱导和形成， NOS与NO可影响学习记忆等过程，nNOS 被认为是影响学习记忆的关键酶.

　　海马是脑组织对缺氧缺血最敏感的部位之一，脑缺氧缺血时，由于能量代谢衰竭，可致离子泵功能障碍，兴奋性氨基酸释放，大量Ca2＋内流，激活Ca2＋依赖性NOS，导致NO的过量合成，NO在缺氧缺血性脑损害中的作用已日益受到重视. 任何来源的NO在高浓度时均可抑制多种线粒体电荷传递系统的酶，从而抑制细胞呼吸和能量代谢；NO还可以通过与氧自由基反应形成活性更高的毒性基团，通过脂质过氧化作用、酶灭活及DNA硝化作用导致神经元的死亡. 有实验表明NO作为一种血管、神经活性物质，具有调节脑血流、促进或抑制神经递质释放、参与突出可塑性、神经元兴奋毒性及炎症损害等多种作用，且与学习和记忆有关. 据报道给大鼠腹腔注射NOS抑制剂，可损害大鼠学习记忆能力，而注射NO的合成原料可减轻这种损伤，脑组织NOS的持续性激活及一氧化氮含量的升高不仅参与缺血性脑损害，而且在痴呆形成中可能发挥重要作用［2］. 本结果显示VD小鼠海马CA1区NOS及nNOS阳性神经元数量明显升高，并且与行为学上变化相一致，而CA3区和DG无明显变化，这可能与海马CA1区是缺氧易损区、海马CA3区和DG是缺氧抵抗区有关［3］，说明海马中的NOS阳性神经元可能参与了VD的形成，为将来探讨VD的防治提供了进一步研究的基础.

　　【】

　　［1］王蕊，杨秦飞，唐一鹏，等. 大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进［J］. 病理生理杂志，2000,16（10）:914-916.

　　［2］Meyer RC, Spangler EL, Patel N, et al. Impaired learning in rats in a 14unit Tmaze by 7nitroindazole, a neuronal nitric oxide synthase inhibitor, is attenuated by the nitric oxide donor, molsidomine ［J］. Eur J Pharmacol, 1998, 341(1):17-22.

　　［3］宋立新,张金波,王亚军,等. 急性重复缺氧小鼠海马CA1区的超微结构观察［J］. 武警医学,2000, 11(6): 326-329.