乙酰肝素酶shRNA双基因共表达真核载体的构建和筛选
【关键词】 乙酰肝素酶
Construction and identification of eukaryotic expression vector expressing double shRNA sections targeting heparanase gene
【Abstract】 AIM: To construct and identify eukaryotic expression vector expressing double shRNA sections targeting heparanase gene (HpashRNA). METHODS: Six pairs of oligonucleotides were designed and chemically synthesized. After randomly connecting an oligonucleotide and another one with 4-8 bases pairs interval, they were directionally inserted into plasmid pGenesil1 with respectively U6 promoter and termination code, the common green fluorescence protein (EGFP) gene and Neo gene. In this way, 3 vectors of pGenesil1HpashRNA containing 2 sections of HpashRNA were constructed and they were transfected into the ovarian cancer cell SKOV3. The rate of transfection was detected by flow cytometry and fluorescence microscope. The inhibition effectiveness of Hpa protein was analyzed by immunohistochemical staining. RESULTS: The constructed eukaryotic expression vectors effectively suppressed the Hpa expression in transfected cells. The 3 vectors of different short hairpin RNA of Hpa effectively suppressed the expression in SKOV3（P<0.01）. CONCLUSION: We have constructed a eukaryotic expression vector of shRNA, specific for Hpa and have constructed and identified a eukaryotic expression vector of doublegene short hairpin RNA for Hpa.
【Keywords】 heparanase; U6 promoter; shRNA; eukaryotic expression vector
【摘要】 目的： 构建并筛选有效的、编码2条shRNA的乙酰肝素酶(Hpa)特异性基因真核表达载体. 方法：分别设计、化学合成6对寡核苷酸单链，经退火、连接和磷酸化后得到HpashRNA双链，将两两随机间隔4～8个碱基后定向克隆入带有各自的Ｕ6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, EGFP）基因和Neo基因的pGenesil1中，构建3 条含两段Hpa基因shRNA的pGenesil1HpashRNA真核表达载体,转染卵巢癌细胞株SKOV3，流式细胞仪和荧光显微镜下观察转染效率，免疫组化分析Hpa蛋白表达. 结果：酶切与测序证实pGenesil1HPSEshRNA构建成功,无任何碱基突变，3组质粒转染细胞均有Hpa表达的变化，3种不同shRNA质粒转染细胞后Hpa蛋白表达有明显差别. 结论： 构建并筛选了针对Hpa特异性的双基因shRNA真核表达载体pGenesil1HpashRNA.
【关键词】 乙酰肝素酶; U6启动子; 短发夹RNA; 真核表达载体
0引言
在整体或细胞水平转移外源基因进行遗传学改变、修饰是目前基因的重要方式. 基于此理的RNA干扰(RNA interference, RNAi)通过采用一小段RNA(small interference RNA, siRNA)特异性地关闭特定基因使之“沉默”,失去其功能以达到相应治疗作用成为基因治疗新的靶点［1］. 但低效率的基因转移过程通常是基因治疗的瓶颈, 通过构建多基因共表达载体成为解决这一问题的策略之一. 乙酰肝素酶（heparanase,Hpa）是近几年逐步明确的参与肿瘤转移过程的葡萄糖醛酸酯酶，可降解细胞外基质中的乙酰肝素蛋白聚糖，破坏基质状结构，使膜的功能降低，更易于肿瘤组织扩散［2 ］. 为此，我们通过自行设计并构建包含两段HpashRNA的、携带有各自的Ｕ6启动子和终止码、共同的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, EGFP）基因和Neo基因的pGenesil1HpashRNA载体,利用质脂体介导的方法转染卵巢癌细胞株SKOV3，分析RNAi对Hpa基因表达抑制作用，探讨多基因共表达的增效可能.
1材料和方法
1.1材料
线性化的质粒载体pGenesil1（武汉晶赛生物公司）；工具酶（日本TaKaRa公司）；质粒提取盒（中鼎公司）；METAFECTENE转染试剂（德国Biontex公司）；dsDNA片段（武汉晶赛生物工程公司化学合成）；山羊抗人Hpa多克隆抗体（Santa Cruz公司）；SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂（棕色）（武汉博士德公司）.
1.2方法
1.2.1发卡样Hpa基因（HpashRNA）设计根据GenBank提供的Hpa基因cDNA序列,通过基因Blast验证,挑选6条长各为21个碱基的特异性寡核苷酸序列5′ GTACTTGCGGTTACCCTAT ３′; 5′ GCTTCGTACCTTGGCCAGA ３′; 5′ TTGCTACTCCGAGAACACT ３′; 5′ TGGGTCGCAGTTAGGAGAA ３′; 5′ GGAAGCTTCGAGTATACCT ３′; 5′ GCTTCGAGTATACCTTCAT ３′. 分别在5′和3′端引入BamH I和Hind III酶切位点,按如下结构BamHI+Sense+Loop+Antisense+终止信号+Sac I/EcoR I/Sac I/Sal I/Sal I/Xba I+Hind III化学合成有发卡样结构的shRNA寡核苷酸单链,同时合成互补链.
1.2.2pGenesil1HpashRNA的构建用50 μL annealing buffer溶解上述单链目的基因片段. 各取2 μL单链+16 μL annealing buffer，94℃退火冷却至室温. 用双链退火连接后再磷酸化的退火片段分别与线性化Pgenesil1载体连接，22℃水浴反应过夜,构建的阳性克隆命名为pGenesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）, pGenesil1HpashRNA（3）.
1.2.3pGenesil1HpashRNA扩增及纯化各取5 μL连接产物转化感受态细胞DH5а，涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜. 各挑取3个单克隆菌落接种于3 mL含Kanar抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜. 收集菌液,小量快速抽提质粒DNA,15 g/L琼脂糖凝胶电泳，部分菌液送上海申友公司测序.
1.2.4细胞转染及表达鉴定提取3种重组质粒，并进行DNA定量. SKOV3细胞生长到占瓶底约80%～90%时，分为pGenesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）, pGenesil1HpashRNA（3）及非特异性shRNA片段对照4组，按照METAFECTENE转染试剂盒操作方法转染，以含800 mg/L G418的RPMI 1640培养液培养4 wk，筛选阳性克隆. 荧光显微镜观察EGFP的表达并照相.
1.2.5流式细胞仪检测转染效率将1×107/L的培养细胞用2.5 g/L胰酶消化，PBS清洗,上流式细胞仪（美国BO公司，FACSealiber)检测,激发光为488 nm,接收光为530 nm. 用Cellquest软件进行数据获取与分析.
1.2.6免疫组化染色检验细胞Hpa蛋白表达细胞爬片，乙醇固定，按SABC方法染色. 胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，每张切片在400倍显微镜下随机计数300个细胞. 阴性（－）：不着色；阳性（+）：细胞质内有细小稀疏黄色颗粒；（）：细胞质内有较密的细小黄色颗粒；（）：细胞内有明显的细小黄色颗粒. 将结果按下面公式. 细胞Hpa蛋白表达积分＝（+）%×1+（）%×2+（）%×3.
2结果
2.1pGenesil1HpashRNA重组质粒的构建重组质粒用BamH I做酶切鉴定,阳性克隆产生400 bp的片段. 证实已将合成的DNA片段成功插入载体pGenesil1中（图1）.
2.2测序分析经测序结果证实3个质粒构建部分的碱基序列与设计DNA片段完全一致，碱基无突变. 表明已成功构建含两段目的shRNA片段的重组质粒载体.
2.3转染效率稳定转染4 wk后，荧光显微镜下发现转染后经G418筛选出的阳性克隆荧光表达强烈、稳定，经消化传代后仍有较强表达，表明质粒已成功转入细胞中（图2）.
2.4流式细胞仪检测转染效率非特异性对照组细胞荧光表达率为67.58%，pGenesil1HpashRNA（1）为65.23%，pGenesil1HpashRNA （2）为78.63%，pGenesil1HpashRNA（3）为68.56%，达到常规实验要求.
2.5免疫组化染色非特异性对照组细胞表达仍然较强，几乎大部分细胞Hpa表达阳性，且胞质丰富，细胞膜轮廓清晰，着色深. 3组实验细胞阳性染色率降低，胞质疏松，细胞膜界限不清晰. 其中以pGenesil1HpashRNA （2）的表达降低尤为明显，与对照组比较有显著性差异（P<0.05,表14种质粒转染SKOV3细胞中Hpa的表达(略)
3讨论
基因转移是基因的关键步骤. 目前，基因治疗研究中多采用一个载体克隆一个或一种相关基因. 同时转移并表达多个外源基因在基因治疗领域仍然是一项空白. 通过两种途径可以较好解决这一难题：一是多个携带不同基因的独立载体系统同时转染靶细胞；二是在同一载体上构建、表达多个基因［1］. Zhu等［2］以蓝、绿和黄三种不同荧光蛋白报告基因构建含一个内部启动子、两个IRES元件的三顺反子，瞬时转染293细胞，发现三种蛋白都检测到较强荧光信号，三个基因表达效率相似. RNAi是生物界一种古老且高度保守的现象,是基因转录后沉默作用的重要机制之一［3-5］. RNAi在基因功能研究、抗肿瘤和抗病毒基因治疗方面均得到广泛应用［6-8］.
我们构建带有U6独立启动子、表达两个HpashRNA基因的质粒载体pGenesil1HpashRNA，目的在于通过一个载体编码多个shRNA的方法，更有效地选择抑制片段和扩大抑制效率，探讨多基因共表达产生增效作用的协同性和可能性. pGenesil1质粒是以pEGFPC1质粒为骨架改造获得的. pEGFPC1质粒已广泛用于哺乳动物细胞多年，它有荧光蛋白表达，非常方便导入效果检测，在MCS插入带有独立启动子和终止信号的HpashRNA，其重要的结构特点是具有U6启动子,能够转录一些短的具有发夹型结构的小RNA，起到转录后干涉Hpa蛋白合成的作用. 该载体同时具有EGFP和Neo/kan等选择性标志基因,不仅能用于观察转染效率和建立稳定表达shRNAs的细胞克隆，还为进一步的基因治疗打下基础. 实验中转染细胞经过G418筛选后，细胞形成良好的抗性克隆，经荧光显微镜和流式细胞仪分析，均检测到较强荧光信号，表明装载到质粒上的基因片段通过质脂体的介导成功转入细胞内并高表达EGFP.
shRNA的产生主要有化学合成、体外转录和用质粒或腺病毒表达载体直接在细胞内表达siRNA等几种主要的方式, 我们采用的化学合成dsRNA方法简便，dsRNA质量高，容易导入细胞，基因封闭干扰效果可靠，既可筛选shRNA，又可直接作为shRNA使用. 质粒表达载体在细胞内直接转录shRNA，方法、易操作,可建立稳定表达shRNA的细胞克隆，延长RNA干涉效应［9］. 实验结果表明，不同序列和结构的shRNA所介导的基因敲出，效率和特异性差异明显. 我们根据shRNA设计特定规则［10］, 采用了一个载体编码2个shRNA的方法，采用体外化学合成两段Hpa基因特异性的shRNA的寡核苷酸片段,构建了3个能够稳定表达shRNA的pGenesil1HpashRNA重组质粒，将其转染SKOV3卵巢癌细胞，用G418筛选出稳定的细胞克隆. 3组细胞克隆中,Hpa的表达均受到一定的抑制. 其中以5′ TTGCTACTCCGAGAACACT ３′和5′ TGGGTCGCAGTTAGGAGAA ３′组合产生的抑制作用更明显. 多个表达盒构建于一个载体上，能够转录出多种不同的短发夹型结构的小RNA，简单而可靠，但可能存在启动子抑制现象或基因重排. 这种抑制作用和重排不是绝对的，有时染色质结构的改变也会导致两个启动子同时高效转录. 通过多方筛选，可得到较好的组合.
研究结果表明，shRNA抑制作用和抑制效率具有片段特异性. 一个载体编码同一基因的多个shRNA或编码多个基因的shRNA，产生增效的或不同作用的RNA干涉功能将成为一种可能.
【】
［1］ Rye PD, Stigbrand T. Interfering with cancer: A brief outline of advances in RNA interference in oncology ［J］. Tumor Biol, 2004, 25:329-336.
［2］ Zhu J, Musco ML, Grace MJ. Threecolor flow cytometry analysis of tricistronic expression of eBFP, eGFP, and eYFP using EMCVIRES linkages ［J］. Cytometry， 1999， 37:51-59.
［3］ Boyd DD, Nakajima M. Involvement of heparanase in tumor metastases: A new target in cancer therapy? ［J］. J Natl Cancer Inst, 2004； 96:1194-1195.
［4］ Jiang M, Rubbi CP, Milner J. Gelbased application of siRNA to human epithelial cancer cells induces RNAidependent apoptosis ［J］. Oligonucleotides, 2004， 14:239-248.
［5］ Scherr M, Battmer K, Schultheis B, et al. RNA interference (RNAi) as an option for antibcrabl therapy ［J］. Gene Ther, 2005， 12:12-21.
［6］ Ryther RC, Flynt AS, Phillips JA 3rd, et al. siRNA therapeutics: Big potential from small RNAs［J］. Gene Ther， 2005， 12:5-11.
［7］ Fougerolles A, Manoharan M, Meyers R, et al. RNA interference in vivo: Toward synthetic small inhibitory RNAbased therapeutics ［J］. Methods Enzymol, 2005， 392:278-296.
［8］ Seki M, Iwakawa J, Cheng H, et al. p53 and PTEN/MMAC1/TEP1 gene therapy of human prostate PC3 carcinoma xenograft, using transferringfacilitated lipofection gene delivery strategy ［J］. Hum Gene Ther, 2002， 13:761-773.
［9］ Paddison PJ, Caudy AA, Sachidanandam R, et al. Short hairpin activated gene silencing in mammalian cells［J］. Methods Mol Biol, 2004，265:85-91.
［10］ 刘军，郭颖，薛采芳，等. 哺乳动物细胞siRNA表达载体构建及鉴定［J］. 第四军医大学学报，2003， 24:2235-2237.
