稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因P815细胞克隆的建立

                                  作者：韦三华，尹文，雷迎峰，胡兴斌，杨敬，吕欣，孙梦宁，徐志凯

【关键词】  丙型肝炎病毒

    　Establishment of stably transfected P815 cell line expressing multiepitope gene of hepatitis C virus

　　【Abstract】 AIM: To construct a eukaryotic expression vector of HCV compound multiepitope gene and obtain a stably transfected P815 cell line. METHODS:  The cDNA sequence Ct encoding truncated HCV core gene lacking parts of the carboxylterminal region was amplified by PCR and inserted into shuttle plasmid pDE22. HCV multiepitope gene Em from E2 and nonstructual proteins were synthesized and inserted into pDE22. CtEm was obtained by BamHⅠ/Hind Ⅲ and cloned into the eukaryotic expressing vector pcDNA3.1(-) which was digested by BamHⅠ/Hind Ⅲ and the recombinant plasmid pcDNA3.1(-)CtEm was obtained. After sequencing, pcDNA3.1(-)CtEm was transfected to P815 with liposome and screened by G418 and obtained the stably transfeced cell line. RESULTS:  The eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)CtEm was constructed, transfected to P815 and stably expressed HCV compound multiepitope gene, which was confirmed by RTPCR, IFA and Westernblot. CONCLUSION:  A eukaryotic expression vector of HCV compound multiepitope gene has been constructed, stably transfected cell line obtained and the target cells established for analyzing CTL function in the study of HCV vaccine.

　　【Keywords】 hepatitis C virus; epitope; eukaryotic expression；transfection

　　【摘要】 目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的P815细胞克隆. 方法：PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCV E2区模拟表位和NS3~NS5七个T细胞表位基因Em；分别克隆入穿梭质粒载体pDE22中. 用BamHⅠ/HindⅢ双酶切pDE22得到复合多表位基因CtEm，再将CtEm亚克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)，构建重组质粒pCDNA3.1(-)CtEm，经酶切鉴定及测序正确后，通过脂质体转染至P815细胞，持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系，用RTPCR，IFA，Westernblot证实该稳定转染细胞系可以表达多表位基因. 结果：构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)CtEm，建立了稳定转染的P815细胞系. 结论：构建HCV多表位基因的真核表达载体，稳定转染P815细胞，为进一步在疫苗研究中分析 CTL功能建立了靶细胞.

　　【关键词】 丙型肝炎病毒；表位；真核表达；转染

　　0引言

　　丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）引起的. HCV高变异性使预防HCV感染的疫苗研制长期以来进展甚微，亟待开发有效的预防和性疫苗. 我们利用基因重组技术，把含HCV截短C基因、HVR1模拟表位基因及NS3，NS4，NS5的优势Th与CTL表位基因串联，组成HCV复合多表位基因，构建入大肠分枝杆菌穿梭质粒，转化入BCG并筛选重组株，构建新型疫苗. 但由于HCV研究中缺乏细胞模型，使疫苗评价中缺乏靶细胞. 我们在构建穿梭质粒后，将复合多表位基因亚克隆入真核表达载体，转染P815细胞，为疫苗效果评价中CTL杀伤实验建立靶细胞.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　真核表达载体pcDNA3.1(-)，P815细胞、菌种DH5α均由本室保存. Trizol试剂购于Gibco公司.脂质体购于Invitrogen公司.  Taq DNA聚合酶、内切酶购于TaKaRa公司.  逆转录试剂盒购于Promega公司. RPMI Medium 1640培养基、异硫氰酸荧光素和辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG均购于华美公司. 含有HCVH株全基因组序列的质粒（pBRTM/HCV 1-3011）由美国华盛顿大学微生物学系Rice H教授惠赠.

　　1.2方法

　　1.2.1羧基端部分缺失的HCV C区基因扩增根据HCVH株C区基因序列设计特异性引物. 正向引物P1： 5′GCCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAACCT3′，引入BamHⅠ酶切位点；反向引物P2：5′GCAAGCTTTTAGCCATGCGCCAGGGCCCT3′，引入PstⅠ酶切位点. PCR模板为pBRTM/HCV 1-3011,以引物P1, P2扩增HCV核心区氨基端144个氨基酸(432 bp). PCR产物胶回收,记作Ct.

　　1.2.2多表位基因的合成及连接参照［1］，选择E区的模拟表位和非结构蛋白区的优势表位，每个表位两端各保留3个氨基酸，各表位间用AAY分隔连接，以便于各表位保持独立性和能够有效呈递. 5′和3′端分别引入PstⅠ和 HindⅢ酶切位点. 全序列510 bp分成6段S1~S6，序列间添加交叉互补序列，合成后用PCR方法退火连接，得到全长的多表位基因序列Ep，克隆入PGEMTeasy载体，计作TEp.

　　1.2.3复合多表位基因与载体连接、转化及鉴定真核表达载体为pcDNA3.1(-)，先将PCR扩增得到的截短型C基因Ct用BamHⅠ/PstⅠ双酶切后，插入到大肠分枝杆菌穿梭质粒pDE22中的相应位点，构建pDE22Ct；再将多表位基因TEm用PstⅠ/HindⅢ双酶切后插入到pDE22Ct中的相应位点，构建成pDE22CtEm重组穿梭质粒，最后用BamHⅠ/HindⅢ将CtEm切下，连接入用同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)中，构建成重组真核表达载体pcDNA3.1(-)CtEm，不改变其编码区的框架结构. 重组质粒pcDNA3.1CtEm的鉴定采用双位点单酶切鉴定，酶切鉴定得到的阳性克隆送TaKaRa公司进行核苷酸序列测定，用生物软件pcgene分析汇果.

　　1.2.4细胞培养和G418工作浓度的筛选常规培养P815细胞于12孔板中，50 mL/L CO2，37℃，培养基为RPMI 1640 (100 mL/L胎牛血清,100 mg/L青、链霉素,2 mmol/L谷氨酰胺)，至细胞密度达80%布满时，加入含G418的培养液1 mL/孔（G418终浓度分别为100～800 mg/L，8孔）. 换液时保持G418浓度稳定不变，持续培养3～4 wk. 800，700，600 mg/L孔于第3日、 500，400，300 mg/L孔于第5日、200 mg/L孔于第6日开始出现生长抑制现象，细胞开始溶解. 20 d后，G418浓度≤300 mg/L的各孔细胞稳定生长，而≥400 mg/L的细胞孔相继全部死亡. 可以认为在本实验条件下G418的最佳工作浓度为300 mg/L.

　　1.2.5细胞转染与筛选稳定细胞克隆采用脂质体法转染,具体操作按LipofectAMINE 2000说明书进行. 转染48 h后细胞用胰酶消化，细胞计数，按每孔40个细胞转移至96孔板. 按终浓度300 mg/L加入含G418的100 mL/L RPMI 1640培养液，100 μL/孔，继续培养3 wk后，获得稳定生长的细胞克隆，将其依次转移至24孔板、6孔板和培养瓶扩大培养. 获得的细胞克隆冻存2 mo后复苏，检测细胞克隆的稳定性.

　　1.2.6RTPCR检测稳定转染细胞的mRNA将稳定生长的细胞用PBS清洗一次后，参照说明书用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，然后反转录合成cDNA，按SuperScriptTM II反转录试剂盒（Gibco公司）操作说明进行. 用引物P1和P2对反转录产物进行PCR.

　　1.2.7重组质粒在宿主细胞中表达的检测无菌盖玻片放入24孔板，用胰蛋白酶消化稳定生长的细胞，吹匀，将之加入24孔板中，37℃, 100 mL/L CO2孵育48 h后，取出盖玻片，冷丙酮固定15 min，吹干. 采用间接免疫荧光(IFA)方法， 用丙型肝炎患者阳性血清（1∶50稀释）作为一抗结合，37℃孵育1 h，PBS洗，吹干. 再加1∶50稀释的FITC标记的的羊抗人IgG，37℃孵育1 h，PBS洗，吹干. 荧光显微镜下观察. 同时以转染空载体的P815做为对照，伊文斯蓝衬染.

　　1.2.8Westernblot检测目的蛋白的表达收集稳定转染的细胞及未转染的对照组细胞，分别用冷PBS洗2次后，加入裂解缓冲液，水浴30 min后，将裂解物以12 000 g离心5 min，收集上清，样品蛋白经120 g/L SDSPAGE分离后，电转移到硝酸纤维素薄膜（滤膜孔径0.22 μm，转移条件为恒流、100 V，1 h）上，转印膜在50 g/L BSA中封闭过夜. 用丙型肝炎阳性患者血清作一抗，羊抗人IgG作为二抗，DAB（0.6 g/L）显色，至目的条带染色清晰时终止反应.

　　2结果

　　2.1截短型C基因及多表位基因Em的扩增以pBRTM/HCV 13011为模板，设计的引物P1，P2扩增后得到450 bp片段，与预期大小相符. 用S1和S6作为上下游引物对合成的表位基因退火连接产物进行PCR扩增得到全长的多表位基因序列Em，大小为510 bp，与预期大小相符（图1）.

　　2.2重组质粒pcDNA3.1(-)CtEm的鉴定pcDNA3.1(-)CtEm经BamHⅠ+HindⅢ双酶切得到948 bp的预期片段（图2）. 酶切鉴定的阳性克隆经测序与设计序列完全一致. 表明目的基因成功克隆入真核表达载体.

　　2.3RTPCR检测稳定转染细胞的mRNA用引物P1和P2对反转录产物进行PCR. 扩增后得到450 bp片段，与预期片段大小相符（图3）.

　　2.4重组质粒pcDNA3.1(-)CtEm在P815细胞中表达IFA检测结果见图4. 在重组质粒转染的

　　2.5目的蛋白的Westernblot在Mr 35 000处可见目的条带染色清晰（图5）.

　　3讨论

　　HCV感染过程中易产生变异株使其疫苗研究进展缓慢，需要开拓新的思路,有效克服HCV高变异性的新型疫苗. 我们构建了HCV复合多表位基因新型重组BCG疫苗. 为此，需建立能稳定表达该重组蛋白的靶细胞，为疫苗评价提供依据.

　　为使多表位基因能有效表达，我们在表位选择方面进行了优化组合. HCV核心区在各种基因型HCV中最为保守，其诱导的细胞免疫应答对于HCV感染的恢复起重要作用，对研制HCV疫苗有重要的应用价值［2-4］. 但核心蛋白所含碱性氨基酸较多，全长型核心蛋白很难获得稳定表达，而截短型核心蛋白，通过羧基端缺失去除疏水区对表达的影响，原核表达高效且稳定,在真核细胞中也有较高水平的表达［5］. HCV E区的中和抗原位点是产生体液免疫的关键区域，但HCV E2区存在高变区（HVR1）. 我们采用的HVR1模拟表位可使其抗原性更强、更广谱，与HCV感染患者血清的反应率可达53%~80%［6,7］. HCV非结构区存在多个优势Th与CTL表位，我们选择了NS3，NS4，NS5区的7个报道最多，经多种方法证实的Th与CTL优势表位串联，通过对间隔(spacer)序列的优化［8］，提高它们被加工递呈的效率，以期获得较好的免疫效果. 我们对多表位基因在原核系统进行表达，证实其能被稳定高效表达.

　　在疫苗的实验研究中，研究CTL的功能特性必需建立稳定、高效表达某种抗原的细胞系作为靶细胞. 目前HCV没有合适的细胞模型，因此需要建立HCV抗原特异性的靶细胞，我们将HCV重组真核表达质粒pcDNA3.1CtEm用脂质体法转染小鼠肥大细胞瘤P815，经G418筛选，有限稀释法筛选，获得了表达复合多表位基因的细胞克隆.该转染细胞克隆可作为研究细胞免疫的CTL杀伤实验的靶细胞，为进一步的基因免疫和新型BCG活载体疫苗的研究奠定了基础.

　　【】

　　［1］ Ward S, Lauer G, Isba R, et al. Cellular immune responses against hepatitis C virus: The evidence base 2002［J］. Clin Exp Immunol, 2002, 128:195-203.

　　［2］ DuenasCarrera S, Vina A, Martinez R, et al. Immunization with a DNA vaccine encoding the hepatitisCvirus structural antigens elicits a specific immune response against the capsid and envelope proteins in rabbits and Macaca irus (crabeating macaque monkeys) ［J］. Biotechnol Appl Biochem, 2004，39(Pt 2):249-255.

　　［3］ Isaguliants MG, Petrakova NV, Kashuba EV, et al. Immunization with hepatitis C virus core gene triggers potent Tcell response, but affects CD4+ Tcells［J］. Vaccine, 2004, 16;22(1314):1656-1665.

　　［4］ 冯志华,周永兴,贾战生，等. 丙型肝炎病毒核心基因免疫诱生细胞免疫应答研究［J］. 中华内杂志，1999，38（7）：462-465.

　　［5］ 胡刚，薛小平，董晓慧，等. 丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达［J］. 生物技术，2004，14（4）：4-5.

　　［6］ AlvarezObregon JC, DuenasCarrera S, Valenzuela C, et al. A truncated HCV core protein elicits a potent immune response with a strong participation of cellular immunity components in mice［J］. Vaccine, 2001，19(2829):3940-3946.

　　［7］ Zhang XX, Deng Q, Zhang SY, et al. Broadly crossreactive mimotope of hypervariable region 1 of hepatitis C virus derived from DNA shuffling and screened by phage display library［J］. J Med Virol, 2003，71(4):511-517.

　　［8］ Velders MP,  Weijzen S,  Eiben GL, et al. Defined flanking spacers and enhanced proteolysis is essential for eradication of established tumors by an epitope string DNA vaccine［J］. J Immunol, 2001，166(9):5366-5373.