稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立

                           作者：雷迎峰，尹文，薛小平，杨敬，吕欣，韦三华，胡兴斌，孙梦宁，徐志凯

【关键词】  丙型肝炎病毒

    Establishment of stably transfected HepG2 cell line expressing HCV scNS4A/NS3 protease

　　【Abstract】 AIM: To construct a eukaryotic expression vector of HCV single chain serine protease (scNS4A/NS3) and to obtain its stably transfected HepG2 cell line. METHODS:  According to the sequence of HCV scNS4A/NS3 gene from the literature, the primers amplifying the gene coding scNS4A/NS3 protease were designed. HCV RNA was extracted from the HCV positive serum and the gene coding scNS4A/NS3 protease was amplified via RTPCR. The PCR product was digested by BamHⅠ/HindⅢ and purified by gel extraction. This fragment was inserted into pcDNA3.1(-) with T4 ligase and transformed into E.coli JM109. The positive recombinant plasmid was selected and identified via sequence assay and restrictive enzyme digestion. The recombinant plasmid was then transfected into HepG2 cell by LipofectAMINE2000. The cells containing stable transformants were selected by the ability of resistance to G418. The stably transfected cell line was identified by RTPCR and IFA and Westernblot. RESULTS:  The eukaryotic expression vector named pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3 was successfully constructed  and the stably transfected HepG2 cell line which expressed scNS4A/NS3 protease was obtained. CONCLUSION:  The stably transfected HepG2 cell line expressing single chain serine protease facilitates the establishment of cellbased system in evaluating antiHCV serine protease drug.

　　【Keywords】 hepatitis C virus; single chain serine protease; lipofectamine, transfection; colone cells

　　【摘要】 目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A/NS3）的真核表达载体；建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆. 方法：根据报道设计扩增scNS4A/NS3编码基因的引物，从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA，RTPCR方法扩增出scNS4A/NS3基因片段， BamHⅠ/HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)，转化菌株JM109感受态细胞，获得重组质粒pcDNA3.1(-)～scNS4A/NS3，经酶切鉴定及序列测定. 将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞，经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系，用RTPCR，IFA，Westernblot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白. 结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3；建立了稳定转染的HepG2细胞克隆，命名为scpHepG2. 结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础.

　　【关键词】 丙型肝炎病毒；单链丝氨酸蛋白酶；转染，脂质体法；细胞克隆

　　0引言

　　稳定、可靠的细胞培养系统和小动物实验模型的缺乏极大地制约着抗丙型肝炎病毒(HCV)研究的深入和［1］. 因此以在HCV RNA复制和蛋白前体加工成熟中起着关键作用的酶分子为靶位的测定系统常被用于抗HCV 药物的筛选. 酶抑制剂作为一个有潜力的药物分子，它不仅需要有效，也需要有良好的药物动力学等特征，如易进入细胞、结构稳定. 所以建立一种可以在细胞水平上评价酶活性的细胞系统非常关键. NS3丝氨酸蛋白酶在HCV多聚蛋白前体加工成熟中起关键作用，是抗HCV研究的主要靶标分子［2］. 我们通过构建HCV单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A/NS3）的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物的系统奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　E.coli. JM109菌株、pcDNA3.1(-)质粒由本室保存. Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamHI，HindⅢ等购自TaKaRa公司，胶回收试剂盒购自Vgene公司，T4 DNA连接酶购自上海生物工程公司，FITC和HRP标记羊抗鼠IgG, DNA分子标准、低分子蛋白质标准分别购自华美生物工程公司. 反转录试剂盒SuperscriptⅡ，Trizol，Lipofecatmine2000，G418购自Gibco公司. NS3mAb由本室制备［3］.

　　1.2方法

　　1.2.1HCV RNA的提取与cDNA第一链的合成以HCV阳性患者的血清为材料提取病毒RNA，方法参照Trizol说明书，将RNA沉淀溶于20 μL不含RNase的去离子水. 反转录按SuperscriptⅡ说明书进行，模板为病毒RNA，反转录引物为scNS4A/NS3基因下游引物，最后获得cDNA第一链.
1.2.2scNS4A/NS3基因的PCR扩增文献［4］，设计扩增scNS4ANS3基因的引物: P1,5′ CGGATCCATGGCGCCTATCGGCTCAGTAGTAATCGTAG
GCAGAATCATCCTGTCCGGCCGTGGTGGCCCTATTA
CGGCCTACTCCCAAC 3′; P2, 5′ CGCGGTACCTAGGCAAAACCAGAACCAGC 3′. 上述引物均由上海生工公司合成. 以病毒cDNA第一链为模板扩增scNS4A/NS3基因，体系为：模板5 μL，10×Buffer 5 μL ，10 mmol/L dNTPs 4 μL，p1，p2各2 μL，Taq 2 μL，用超纯水补至终体积50 μL. 条件: 预变性94℃ 5 min，94℃ 1 min，60℃ 50 s，72℃ 1 min共 30个循环， 72℃延伸10 min. 质粒构建按参考文献［5］进行，获得pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3重组质粒. 酶切进行鉴定并交由上海生工公司测序.

　　1.2.3细胞培养和G418工作浓度的确定常规培养HepG2细胞于12孔板中，50 mL/L CO2，37℃，培养基为RPMI 1640 (100 mL/L胎牛血清,100 mg/L青、链霉素,2 mmol/L谷氨酰胺)，至细胞密度达90%布满时，加入含G418的培养液1 mL/孔（G418终浓度分别为200～1000 mg/L，8孔）. 换液时保持G418浓度稳定不变，持续培养3～4 wk.

　　1.2.4细胞转染与筛选稳定细胞克隆①质粒制备：将pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3质粒转化大肠杆菌感受态细胞JM109，挑取菌落接种5 mL LB，37℃振摇，12 h后离心收菌. 用去内毒素超纯质粒提取试剂盒（博大泰克公司）提取质粒，紫外分光光度法测定DNA含量和纯度. ②细胞转染：将HepG2细胞培养于24孔板，待细胞90%铺满，采用脂质体法转染pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3,具体操作按LipofectAMINE 2000说明书进行. ③建立稳定的细胞克隆：采用G418压力选择. 上述转染48 h后，通过G418压力筛选2 wk后，细胞成团，用枪头挑取单个细胞团种在96孔板，继续加G418压力选择，直到最后获得单独稳定生长的细胞克隆，扩大培养后检测并冻存. 获得的细胞克隆冻存2 mo后复苏，检测细胞克隆的稳定性.

　　1.2.5稳定转染细胞系的检测①RTPCR检测稳定转染细胞中目的基因的mRNA： 将稳定生长的细胞用PBS清洗一次后，参照说明书用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，然后反转录合成cDNA，按SuperScriptTM II反转录试剂盒（Gibco公司）操作说明进行. 用P1和P2对反转录产物进行PCR. PCR反应体系及反应条件同前. ②免疫荧光检测：用胰蛋白酶消化稳定生长的细胞，吹匀，将之加入镀膜片小孔中，每孔15 μL，置于湿盒中，37℃, 50 mL/L CO2培养箱培养12 h，40 g/L多聚甲醛固定，NS3 mAb作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗，500 g/L的甘油封闭后在荧光显微镜下观察. 同时以转染空质粒pcDNA3.1（-）的HepG2做为对照. ③Westernblot检测目的蛋白的表达:在六孔板中培养稳定转染的细胞，待细胞铺满后，用PBS清洗细胞3次，然后每孔加入100 μL 2×SDS上样缓冲液，用细胞刮刀将细胞分离置于离心管中. 用细胞超声粉碎仪破碎细胞，煮沸5 min，离心收集上清备用，同时用空质粒转染的HepG2做对照. 按Biorad垂直电泳仪说明书，配置40 g/L浓缩胶和120 g/L分离胶，取20 μL细胞处理液上样，电压120 V，1.5 h后将蛋白转移至醋酸纤维素膜（NC），NS3 mAb作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，DAB显色.

　　2结果

　　2.1PCR产物和重组质粒的鉴定结果取PCR产物5 μL行10 g/L琼脂糖电泳结果显示扩增出约590 bp的片段,大小与目的片段相符. 重组质粒经BamHⅠ/HindⅢ酶切后，酶切产物大小与预期相符（图1），说明重组真核表达载体构建正确. 序列测定结果与报道相同.

　　2.2G418工作浓度的确定可观察到1000，900，800 mg/L孔于第2日，700和600 mg/L孔于第3日，500，400，300 mg/L孔于第5日，200 mg/L孔于第6日开始出现生长抑制现象，细胞开始溶解. 20 d后，G418浓度≤700 mg/L的各孔细胞稳定生长，而1000，900，800 mg/L的3孔相继全部死亡. 可以认为在本实验条件下G418的最佳工作浓度为800 mg/L.

　　2.3稳定转染HepG2细胞系检测

　　2.3.1RTPCR检测稳定转染细胞的目的基因RTPCR产物行10 g/L琼脂糖电泳. 可见在预期大小处（590 bp）有一条亮带(图2).

　　2.3.2免疫荧光检测稳定转染细胞的目的蛋白在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光主要分布在细胞质. 而转染空质粒pcDNA3.1(-)的HepG2细胞绿色荧光为阴性(图略).

　　2.3.3蛋白印迹检测目的蛋白DAB显色后可见在预期大小（Mr 22 000）处有一特异条带. 而转染空质粒pcDNA3.1(-)的HepG2细胞没有染出条带(图3).

　　3讨论

　　HCV NS3蛋白编码基因全长共1893个核苷酸. NS3蛋白近N端1/3 (1～180aa)具有丝氨酸蛋白酶活性. 近C端2/3具有三磷酸核苷酶(NTPpase)和解旋酶(Helicase)活性［6］. NS3丝氨酸蛋白酶在四个连接区域切割多聚蛋白前体：NS3／NS4A，NS4A／NS4B，NS4B／NS5A，NS5A／NS5B. 随着NS3丝氨酸蛋白酶得到表达和纯化，1996年Kim等［7］分别利用晶体衍射获得了NS3蛋白及蛋白酶的晶体结构，明确了酶活性所需的必需条件和辅助因子,其中NS4A中间的12个氨基酸是丝氨酸活性发挥必需的. Dimasi等［8］将NS4A核心区域通过连接子与NS3丝氨酸蛋白酶区域构建为一条单链蛋白，经原核表达后获得的纯化蛋白具有NS3丝氨酸蛋白酶的活性.

　　本研究中，我们首先设计了扩增单链NS3丝氨酸蛋白酶的引物，上游引物中含有NS4A的核心区21～43aa的基因序列，两者之间设计了一个RGGP的连接序列，该序列可以形成β片层结构，从而使得NS4A能够起到辅助因子的作用，这样保证了单链蛋白具有良好的丝氨酸蛋白酶活性. 以HCV阳性患者的血清为材料，提取病毒RNA，将之反转录为cDNA模板，扩增出了单链丝氨酸蛋白酶的基因序列. 用构建的真核表达质粒pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3转染肝癌细胞系HepG2，获得单独稳定生长的细胞克隆，扩大培养后检测并冻存. 我们用RTPCR方法和间接免疫荧光、蛋白印迹的方法，从基因水平和蛋白水平上检测到单链丝氨酸蛋白酶在细胞获得表达.

　　本实验结果表明，我们成功地构建了包含HCV scNS4A/NS3基因序列的真核表达载体pcDNA3.1(-)scNS4A/NS3，建立了其稳定转染的HepG2细胞株，该细胞株能够稳定表达单链丝氨酸蛋白酶，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物的系统奠定了基础.

　　【文献】

　　［1］ 张景霞,周红超,徐德忠,等. HCV C区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达［J］. 第四军医大学学报, 2002, 23(24):2236-2239.

　　［2］ Hugle T, Cerny A. Current therapy and new molecular approaches to antiviral treatment and prevention of hepatitis C［J］. Rev Med Virol， 2003, 13:361-371.

　　［3］ Yang J. Expression of HCV NS3 protein, preparation of its Mabs and determination of their bingding region ［D］. 第四军医大学研究生学位, 2005:56-58.

　　［4］ Berdichevsky Y, Zemel R, Barchmatov L, et al. A novel high throughput screening assay for HCV NS3 serine protease inhibitors ［J］. J Virol Methods, 2003,107:245-255.

　　［5］ 刘卫东,薛小平,雷迎峰,等. 丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定［J］. 第四军医大学学报, 2003, 24(14):1265-1267.

　　［6］ Rosenberg S. Recent advances in the molecular biology of hepatitis C virus ［J］. J Mol Biol, 2001,313:451-464.

　　［7］ Kim JL, Morgenstern KA, Lin C, et al. Crystal structure of the hepatitis C virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide［J］. Cell, 1996, 87:343-355.

　　［8］ Dimasi N, Pasquo A, Martin F, et al. Engineering,characterization and phage display of hepatitis c virus NS3 protease and NS4A cofactor peptide as a singlechain protein［J］ . Protein Eng, 2000,11(12):1257-1265.