豚鼠海马神经干细胞与两种不同载体材料的生物相容性

                                                                   作者：郭宝凤，董明敏，郭漳生 

【关键词】  神经干细胞

    Biocompatibility between two different biomaterials and cultured hippocampusderived neural stem cells in vitro

　　【Abstract】 AIM: To study the biocompatibility between two different biomaterials (collagen protein sponge and glutin sponge) and cultured hippocampusderived neural stem cells in vitro and to identify whether the materials could be used as scaffold biomaterials in peripheral neural tissue engineering. METHODS:  Hippocampusderived neural stem cells of guinea pigs were cultured and respectively combined with each of the two biomaterials in vitro. The number of cells was counted and the histological changes were observed with HE staining and scanning electron microscope after 7 d and the adhesion rates were detected. RESULTS:  Hippocampusderived neural stem cells attached to both biomaterials and normally grew. The adhesion rates were 31.17%  and 14.87% respectively. The total numbers of the cells in the experimental and control groups were similar and there was no statistical difference. CONCLUSION:  Both biomaterials have a good biocompatibility with hippocampusderived neural stem cells of guinea pigs and  can be used safely as scaffold materials in peripheral neural tissue engineering.

　　【Keywords】 neuronal stem cells; tissue engineering; biomaterials; biocompatibility; guinea pig

　　【摘要】 目的：评价豚鼠海马神经干细胞与2种不同载体材料（胶原蛋白海绵和明胶海绵）的生物相容性,探讨它们作为周围神经组织工程载体材料的可行性. 方法：体外培养新生豚鼠海马神经干细胞，传至第3代，将密度为1×1010/L细胞分别与2种载体材料联合体外培养,1 wk后取材，进行细胞计数，倒置相差显微镜及扫描电镜观察,并测定2种材料与细胞的吸附率. 结果：神经干细胞可以在胶原蛋白海绵和明胶海绵上生长,逐渐黏附，细胞吸附率分别为37.17%和14.87%,统计学分析有显著差异；各实验组与对照组之间细胞总数统计学分析无显著差异. 结论：胶原蛋白及明胶2种材料尤其是胶原蛋白,具有良好的神经干细胞相容性,可以作为周围神经组织工程的支架材料应用于临床.

　　【关键词】 神经干细胞；组织工程；生物材料；生物相容性；豚鼠

　　0引言

　　在应用组织工程修复周围神经的研究中，理想的载体应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性［1-2］. 胶原蛋白是细胞外基质的组成部分，它具有细胞外基质的共性，是细胞赖以生存和维持细胞功能及生物学特征的基础；明胶由胶原蛋白水解而得. 神经干细胞（nerve stem cells,NSCs）由于具有来源广泛、取材容易和多向分化潜能等特点,是一种理想的种子细胞［3-4］. 我们选择豚鼠海马NSCs与胶原、明胶2种载体材料进行体外复合培养，检测其组织相容性,以探讨它们作为周围神经组织工程载体材料的可行性.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　新生（<24 h）豚鼠由郑州大学医学院实验动物中心提供. DMEM/F12基础培养基、神经细胞培养添加剂B27,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),表皮生长因子(EGF),小牛血清(Sigma公司);抗巢蛋白(nestin)mAb、抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP) mAb、 抗神经微丝(NF) mAb, SABC试剂盒(Chemicon公司); 胶原蛋白海绵及明胶海绵(上海其胜生物制剂有限公司).

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养将新生（<24 h）豚鼠以10 g/L水合氯醛腹腔麻醉，750 mL/L乙醇消毒，无菌操作取出脑组织，解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管,分离出海马，用眼科剪剪成1 mm3左右的组织块，加入少量培养液并将其移至10 mL离心管中，用细口吸管反复吹打5~10 min，使成匀浆状，过200目筛网后1500 r/min离心5 min，弃上清，用NSCs基础培养液（DMEM/F12，20 g/L B27添加剂、青霉素1×105 U/L,链霉素1×105 U/L），并加入EGF（终浓度为20 μg/L）和bFGF（终浓度为20 μg/L）定容至5 mL，台盼蓝染色计数. 以1×1010/L密度接种到50 mL培养瓶中，置37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养. 每3 d进行半量补液，6～7 d后将形成的神经球吸出，1500 r/min离心5 min，弃上清，重新加入5 mL干细胞培养液入细胞沉淀中，用细口吸管反复吹打使神经细胞球分散后等比例分装到2个培养瓶，以1传2的比例进行扩增培养，每3 d进行半量补液，再经7～10 d后将重新形成的NSCs球离心吹打再制成单细胞悬液，细胞计数板计数，将传至第3代的细胞密度调整为1×1010/L待用.

　　1.2.2细胞存活率取2 μL细胞悬液与8 μL台盼蓝染液混合，用血细胞计数板计数，3 min内镜下至少计数200个细胞，被蓝染的细胞为死细胞，未着色的细胞为活细胞.

　　1.2.3细胞接种实验分为3组，即胶原蛋白海绵组、明胶海绵组和对照组. 将胶原蛋白海绵和明胶海绵分别制成直径5 mm、厚2 mm大小的圆盘状，用培养液预浸后置入96孔培养板内，每组各32孔，作好标记，余下32孔作为对照组. 取预制好的1×1010/L单细胞悬液每孔接种0.1 mL. 对照组单独接种细胞.

　　1.2.4相差显微镜观察每日使用倒置相差显微镜观察细胞生长、生物材料附着及NSCs生长、分化等情况.

　　1.2.5细胞吸附率测定各组每4孔计为1个样本，每组样本含量为6. 培养1 wk，实验组取出载体，用2.5 g/L胰酶消化后，加培养液反复冲洗，离心收集细胞，加培养液制成0.1 mL细胞悬液，计数，记为吸附细胞数，对应孔内剩余细胞消化、收集、计数，记为游离细胞数，对照组4孔为1个样本进行细胞计数. 吸附率=吸附细胞数/（吸附细胞数+游离细胞数）×100%

　　1.2.6光镜观察接种1 wk后将细胞-胶原海绵复合物及细胞-明胶海绵复合物各取出4块，40 g/L多聚甲醛固定，脱水、透明、包埋，切片进行HE染色，镜下观察载体与细胞的附着情况.

　　1.2.7扫描电镜观察接种1 wk后将细胞-胶原海绵复合物及细胞-明胶海绵复合物各取出4块，25 g/L戊二醛固定,系列脱水,醋酸异戊酯置换,真空干燥,表面喷金后进行观察.

　　1.2.8NSCs的诱导分化和免疫细胞化学鉴定选取生长良好的NSCs球,以一定的密度种植到放有小盖玻片(预先涂有多聚赖氨酸)的24孔板中. 分化培养液为含50 mL/L小牛血清的DMEM/F12（含20 g/L B27添加剂）. 分别于接种后的4 h和1，3，7 d取出小盖玻片,用PBS小心漂洗2遍,吸净液体后,用纯丙酮固定30 min. 采用免疫细胞化学SABC法对贴壁4 h，1 d的NSCs球进行巢蛋白mAb (nestin)免疫细胞化学染色以鉴定其干细胞源性. 将分化培养3，7 d的神经球细胞进行GFAP，NF免疫细胞化学染色.

　　统计学处理： 采用SPSS 10.0统计软件，各组细胞总数的比较采用方差分析，检验水准α=0.05.

　　2结果

　　2.1细胞存活率及生长状况细胞存活率可达90%. 对照组及2实验组载体周边部分的单细胞均在24 h内自动聚集成团；聚集的细胞迅速分裂，到第3日已初步集成圆球形，各种成分掺杂；第5~6日时培养液清亮呈橙红色，可见呈悬浮生长的圆球形细胞构成的神经细胞球. 胶原蛋白海绵周围黏附较多细胞球，换液时轻轻摇动培养板或用吸管轻轻吹打也不能使神经球浮起；明胶海绵组周围细胞生长状态较差，干细胞球较少. 观察各组载体中央及周边透光性较强部位可见神经球悬浮于网孔中或黏附于纤维上.

　　2.2细胞吸附率经统计学处理，2实验组细胞总数与对照组比较无显著性差异，但胶原蛋白海绵组吸附率明显高于明胶海绵组（P<0.05，表1）.表1神经干细胞与2种生物材料的吸附率（略）

　　2.3光镜观察切片HE染色观察，可见胶原被染成深粉色，网状交织，网孔中细胞被染成紫蓝色，以集落形式附着. 明胶海绵网孔较大，可见稀疏的淡粉色线条和少量细胞.

　　2.4电镜观察胶原蛋白海绵组：载体网孔直径为40～100  μm,均匀，呈丝状交织（图1）. 可见NSCs集聚成球状或团簇状，黏附于胶原海绵壁上或孔隙内，各细胞球或团之间通过基质相互连接、重叠（图2）. 明胶海绵组：载体网孔较大，为100～250 μm（图3）. NSCs数量较少，散在分布，细胞圆形，直径3～5 μm（图4）.

　　2.5诱导分化和免疫细胞化学鉴定在培养数小时内即可观察到神经球已贴壁，轻轻摇动培养板可见神经球并不随培养板而晃动，行nestin免疫细胞化学染色呈阳性. 24 h后可见有许多突起自神经球边缘长出,开始小而短，进一步伸长呈放射状. 3 d后分化的细胞及生长的突起在神经球周围相连成片. 7 d后可见种类众多、形态各异的已分化神经组织细胞. 对3，7 d分化的细胞行免疫细胞化学鉴定,大多数细胞为GFAP阳性，少部分为NF阳性.

　　3讨论

　　随着组织工程学的兴起和，组织工程化人工神经已成为外周神经研究中的一个新课题. 若形成新生的组织工程化组织首先需要构建细胞―支架复合物，主要包括合适的种子细胞及细胞载体. 种子细胞是组织工程研究中的要素之一，形成新生的组织需要有一定数量且不会引起机体免疫排斥反应的种子细胞. 以往的研究都将雪旺细胞（Schwann cell,SC）作为种子细胞，但由于自体来源的SC有限且需二次手术，异体的SC具有免疫排斥反应，因此将人工神经应用于临床研究遇到了难以逾越的障碍. 近年来的研究发现，NSCs具有多向分化潜能、低免疫原性、取材容易、来源广泛等特点，因此，无论是从临床应用还是伦理角度都具有更大的优势［3-4］. 目前，NSCs已经广泛用作种子细胞应用于神经系统组织工程.

　　理想的载体材料应该具有良好的组织相容性、生物降解性、生物活性等［5-6］. 目前用于制备载体的材料包括来源于生物体的天然材料和人工合成材料. 天然材料主要是经过或未经过预处理的来源于自体、同种异体或异种生物体的血管、羊膜、肌肉、胶原、凝胶等物质［6-7］. 胶原或称胶原蛋白是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物骨、腱、软骨和皮肤及其他结缔组织中,约占哺乳动物总蛋白的1/3,是机体重要的细胞外基质成份；明胶是一种热水可溶的多肽混合物，由广泛存在于高等动物的皮、骨等结缔组织中的胶原蛋白水解而得. 胶原和明胶这两种材料因具有来源广泛、良好的生物学特性和弱的抗原性,在烧伤、创伤、美容、矫形、创面止血等医药卫生领域的研究已取得了可喜的成果，但作为组织工程载体材料的研究还处于起步阶段.

　　对生物材料相容性研究有很多方法,其中常用的有体内直接植入法和体外复合细胞培养法两种［8］. 体内直接植入由于受多种体内环境因素的影响,不能准确反映生物材料与组织细胞的相容性. 而体外复合细胞培养可以直接观察细胞与生物材料复合生长的情况,较前者更为敏感、客观［9-10］，是近年来研究生物材料相容性的主要方法. 因此,本研究选用2种生物材料:胶原蛋白海绵和明胶海绵与NSCs在体外复合培养,结果发现实验组与对照组细胞总数无明显差异，说明2种生物材料对细胞的生长无明显影响. 通过形态学观察,发现NSCs可以在胶原海绵和明胶海绵周围生长,逐渐黏附,并在其表面形成干细胞球,随着培养时间的延长,细胞长入孔隙内,分泌细胞外基质,细胞连接成片，说明2种材料对细胞有黏附作用. 胶原海绵对神经干细胞的吸附率明显高于明胶海绵，可能是由于胶原海绵的孔隙率较高,孔径较适合细胞黏附生长［11］，也可能与材料处理手段及材料表面性质有关.

　　本实验结果显示，胶原蛋白和明胶2种生物材料，尤其是胶原，与神经干细胞具有良好的细胞相容性，可作为周围神经组织工程的载体材料安全应用.

　　【】

　　［1］ Suh JK, Matthew HW. Application of chitosanbased polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: A review ［J］. Biomaterials, 2000,21(24):2589-2598.

　　［2］ Grande DA, Halberstadt C, Naughton G, et al. Evaluation of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts ［J］. J Biomed Mater Res, 1997,34(2):211-220.

　　［3］ Galli R,Gritti A,Bonfanti L, et al. Neural stem cells: An overview ［J］. Circ Res, 2003,92(6):598-608.

　　［4］ AlvarezBuylla A, Seri B, Doetsch F. Identification of neural stem cells in the adult vertebrate brain ［J］. Brain Res Bull, 2002,57(6):751-758.

　　［5］ Hadlock T, Elisseeff J, Langer R, et al. A tissueengineered conduit for peripheral nerve repair ［J］. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1998,124(10):1081-1086.

　　［6］ Fansa H, Keilhoff G. Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured      Schwann cells for bridging peripheral nerve defects ［J］. Neurol Res, 2004,26(2):167-173.

　　［7］ 葛平江,高志强,曹克利,等. 微波变性自体骨骼肌和异体神经修复面神经缺损的实验研究［Ｊ］. 中华耳鼻咽喉科杂志,2000,35(6):425-428.

　　［8］ 赵廷宝,范清宇,周勇,等. 复合骨形成蛋白骨修复材料的生物相容性研究［J］. 矫形外科杂志, 2002,9(2):155-157.

　　［9］ Neumann A, Reske T, Held M, et al. Comparative investigation of the biocompatibility of various silicon nitride ceramic qualities in vitro ［J］. J Mater Sci Mater Med, 2004,15(10):1135-1140.

　　［10］ Hilts M, Duzenli C.Image filtering for improved dose resolution in CT polymer gel dosimetry ［J］. Med Phys, 2004,31(1):39-49.

　　［11］  Middelkoop E, Henry JC, Ruuls L, et al. Adherence, proliferation and collagen turnover by human fibroblasts seeded into different types of collagen sponges［J］. Cell Tissue Res, 1995,280(2):447-453.