CD14基因启动子多态性与冠心病的关系
作者：韦叶生，刘运广，唐任光，蓝景生
【关键词】 冠状动脉疾病
Association between CD14 gene promoter region polymorphisms and coronary heart disease
【Abstract】 AIM: To study the allele frequencies and genotype distribution of CD14 gene promoter region -159C/T, -260C/T polymorphisms in Chinese patients with coronary heart disease(CHD), and to analyze the association between the serum levels and genotypes of CD14 and CHD. METHODS： The polymorphisms of CD14 gene were analyzed by the polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) methods in 246 patients with CHD and 258 healthy controls, and the serum levels of CD14 were determined by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS： The CHD group showed significantly higher serum levels of CD14 than control group (P<0.01); The distribution of CD14 gene -159C/T polymorphism was not different between CHD group and control group (P>0.05); but the CD14 gene -260C/T polymorphism was significantly different (P<0.05). The relative risk for CHD in T allele carriers was 1.417 times as high as that in C allele carriers (OR=1.417，95%CI：1.106-1.816）, and the serum level of CD14 in T allele carriers was significantly higher than that in noncarriers (P<0.05). CONCLUSION： CD14 gene promoter region -260C/T polymorphism is associated with CHD; and T allele may be a risk factor for CHD; so T allele carriers have a higher risk for CHD by increasing the CD14 expression.
【Keywords】 coronary disease; CD14; gene polymorphism
【摘要】 目的： 研究白细胞分化抗原14(CD14)基因启动子159C/T，260C/T多态性各等位基因及基因型在冠心病患者中的分布频率，分析CD14基因型及血清CD14水平与冠心病的相关性. 方法： 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术，检测246例冠心病患者及258名正常人对照组CD14的基因多态性，同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清CD14水平. 结果： 冠心病组血清CD14水平显著高于对照组(P<0.01)，CD14基因159C/T多态性在冠心病组和正常人群中的分布差异无显著性（P>0.05），而CD14基因260C/T多态性在两组人群中的分布差异存在显著性（P<0.05），等位基因频率的相对风险分析发现，T等位基因携带者患冠心病的风险是C等位基因的1.417倍(OR=1.417，95%CI：1.106～1.816)，携带T等位基因的冠心病患者血清CD14水平显著高于不携带者(P<0.05). 结论： CD14基因启动子260C/T多态性与冠心病的发病具有相关性，其中T等位基因可能是冠心病发病的遗传易感基因；携带T等位基因的个体可能通过促进CD14的高度表达进而增加了冠心病的发病风险.
【关键词】 冠状动脉疾病； CD14； 基因多态性
0引言
冠心病（coronary heart disease，CHD）是严重危害中、老年人生命健康的疾病. 其病因和发病机制尚未完全阐明，但细胞因子在其中的作用越来越受到重视. 白细胞分化抗原14 (cluster of differentiation antigen14，CD14) 是最近几年倍受关注的一种多功能炎症细胞因子，主要由成熟的单核巨噬细胞所产生，它在炎症、免疫反应及动脉粥样硬化形成中起着重要作用，并且与心血管疾病存在着密切关系［1］. 但CD14在冠心病中异常表达的分子遗传学机制尚不清楚. 本研究采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)和酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法，拟探讨CD14基因多态性及血清水平与冠心病的关系，阐明基因型与表型之间的联系，为揭示冠心病的发病机制提供一定的理论依据.
1对象和方法
1.1对象冠心病组：246（男175，女71）例，年龄41～87(61.3±10.8)岁，均为右江民族医学院附属心血管内科的住院患者，冠心病诊断符合1979年世界卫生组织(WHO)制定的标准，并排除糖尿病、家族性高胆固醇血症、甲状腺疾病、肾脏疾病、肝脏疾病等. 对照组：258（男176，女82）例，年龄37～83(59.7±11.2)岁，均为在右江民族医学院附属医院经常规体检，心电图，X线胸片等检查排除了心、脑、肝、肾等疾病的健康体检者. 研究对象为广西地区非血缘个体.
1.2方法采用已建立的改良碘化钠法［2］提取白细胞基因组DNA，-70℃保存备用. PCR扩增：参照［3-4］设计两对引物，由北京赛百盛有限公司合成. 用于特异性扩增CD14基因包含159位点的一段DNA引物序列，上游引物为：5′GTGCCAACAGATGAG GTTCAC3′；下游引物为：5′GCCTCTGACAGTTTATGTAATC3′；扩增CD14基因包含260位点的一段DNA引物序列，上游引物为：5′TGGCCTAAGGCACTGAGGATCAT3′；下游引物为：5′TCAGTTCCCTCCTCTGTGAACCC3′. CD14的PCR扩增反应体系均为50 μL，其中含10×PCR缓冲液5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上、下游引物各40 pmol/L，模板DNA 10.0 μL，TaqDNA聚合酶2.5 U，不足体积用灭菌双蒸水补足至50 μL. 置热循环仪(TC48/H型)中94℃预变性3 min；再按下列程序循环35次，即94℃变性45 s，59℃退火1 min，72℃延伸1 min；末次循环后，72℃延伸5 min. 分别取PCR扩增产物10 μL，用5 U限制性内切酶Ava II酶切CD14基因159位点，37℃孵育2 h；用5 U限制性内切酶Hae III酶切CD14基因260位点，37℃孵育3 h，反应终止后，消化片段分别在20和25 g/L琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，染色后经紫外灯判断结果并拍照. 采用ELISA测定可溶性CD14(sCD14)的血清水平，每次测定均严格按说明书操作. 酶法测定血清总胆固醇（TC）和甘油三酯(TG)；遮蔽法直接测定高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)；apoAI，apoB用双波长免疫透射比浊法测定. 以上测定均在7060型(日本产)全自动生化分析仪上进行，每次测定均选用高、中、低3种质控样品进行质控，以上项目检测质控均符合英国RIQAS国际质控标准.
统计学处理： 用SPSS 10.0软件包进行分析. 基因型和等位基因频率采用基因直接计数法，各组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，并以比值比（OR）及其95%可信区间（95%CI）估计相对危险度. 计量资料用x±s或Md（QR）表示，各组间指标比较依据指标性质，用t检验、非参数秩和检验. P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1CD14基因型分析CD14基因159C/T多态性，PCR扩增产物片段大小为497 bp，根据限制性内切酶Ava II酶切片段的情况，基因型有3种，CC型（497 bp 1条带），CT型（497 bp，353 bp，144 bp 3条带），TT型（353 bp，144 bp 2条带）；CD14基因-260C/T多态性，PCR扩增产物片段大小为268 bp，根据限制性内切酶Hae III酶切片段的情况，基因型有3种，CC型（159 bp，109 bp 2条带），CT型（268 bp，159 bp，109 bp 3条带），TT型（268 bp 1条带）（图1，2）.
1~3：CC基因型；4, 5, 7：TT基因型；6：CT基因型; M：DL2000 marker分子量标准.
图1CD14基因159位点基因型电泳（略）
1, 5：TT基因型；2, 4：CT基因型；3：CC基因型; M：DL2000 marker分子量标准.
图2CD14基因260位点基因型电泳（略）
2.2CHD组与对照组临床资料比较CHD组与对照组在性别和年龄上进行了匹配. CHD组TC，TG，LDLC和sCD14水平均显著高于对照组（P<0.05）；收缩压、缩张压、HDLC，apoA，apoB在两组间比较差异无显著性（P>0.05，表1）.
2.3CHD组与对照组CD14基因多态性的比较CD14基因启动子159位点基因型在CHD组与对照组中的分布差异无显著性（χ2=1.449，P>0.05）；CD14基因启动子260位点基因型在两组人群中的分布差异有显著性（χ2=7.022，P<0.05），等位基因频率在两组人群中的分布也存在着显著性差异（χ2=7.622，P<0.05）；等位基因频率的相对风险分析发现，T等位基因携带者患冠心病的风险是C等位基因的1.417倍（OR=1.417，95%CI：1.106～1.816）；CD14基因159C/T多态性在两组人群中的分布差异无显著性（P>0.05,表2）.
表1冠心病组与对照组临床资料比较（略）
aP<0.05 vs对照组.
表2冠心病组与对照组CD14基因多态性分布（略）
2.4CHD组中各基因型间CD14血清水平的比较在CHD组中，CD14基因159位点各基因型间sCD14血清水平的比较差异均无显著性（P>0.05，阴性数据未列出）；而CD14基因260位点各基因型间（CC，CT和TT基因型）sCD14血清水平两两比较，发现CT基因型携带者的CD14血清水平显著高于CC基因型［（7.98±4.15）μg/mL vs （6.73±3.98）μg/mL, P<0.05］，TT基因型携带者的CD14血清水平也显著高于CC基因型［（8.19±4.37）μg/mL vs （6.73±3.98）μg/mL, P<0.01］，而CT基因型携带者的CD14血清水平与TT基因型比较差异无显著性（P>0.05）.
3讨论
CD14为革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖(LPS)的受体，属细胞表面糖蛋白家族成员之一，主要由成熟的单核巨噬细胞所产生，CD14的主要功能是在LPS结合蛋白的协助下结合LPS并引起细胞活化，引起致炎因子的释放和促凝因子的合成，加速或促进动脉粥样硬化的形成［5］. CD14基因位于第5号染色体5q2331区，在基因启动子区域上游159位点和260位点（转录起始位点上游第159 bp和260 bp）均存在C/T多态性，这两种基因多态性的存在可能影响CD14基因转录和表达［6］，进而影响到CD14的生物学功能，从而影响CD14相关疾病的发生、和转归.
我们通过对246例冠心病患者及258例正常人CD14基因多态性分析，发现冠心病患者CD14基因启动子260C/T多态性分布与正常人比较差异具有显著性（P<0.05），其中携带T等位基因个体患冠心病的风险约是C等位基因的1.417倍（OR=1.417，95%CI：1.106～1.816），提示T等位基因可能是冠心病的危险因素之一. 为了进一步探讨CD14基因多态性与其血清CD14水平的关系，我们检测了冠心病患者及对照者sCD14血清水平，结果发现冠心病患者sCD14血清水平显著高于对照者. 同时我们发现CD14基因启动子260C/T多态性可影响其血清水平，携带T等位基因的冠心病患者血清CD14水平显著高于不携带者（P<0.05），因而我们认为：在病理条件下，携带T等位基因的个体可促进CD14的高度表达进而增加冠心病的发病风险. CD14基因启动子159C/T多态性与冠心病的发病无相关性，对sCD14血清水平也无影响，研究认为这种基因多态性可能在冠心病的发生、发展过程中不直接起重要作用.
综上所述，冠心病是一种多因素参与的常见病，除环境因素影响之外，遗传因素在其中也起着更为重要的作用，通过我们的研究可以发现，CD14基因启动子260C/T多态性与冠心病具有一定相关性，其中T等位基因可能是冠心病的遗传易感基因，携带T等位基因的个体可促进CD14的高度表达而增加冠心病的发病风险. 但CD14基因多态性在冠心病发病中的确切机制尚不清楚，有待进一步研究和探讨.
【】
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