HCV复制子复制效率的影响因素及意义

【关键词】  ,肝炎病毒

    【关键词】  肝炎病毒,丙型；复制子；变异(遗传学)；细胞容受性

　　0引言

　　自1989年丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）发现以来，HCV 体外细胞模型研究一直是HCV 研究的热点问题之一，能在人肝癌细胞系中高水平自主复制的HCV复制子系统的出现，大大加强了HCV体外复制机制的研究. 至1999年复制子模型系统被首次描述以来，这个系统逐步得到了完善. 特别是细胞培养适应性变异及宿主细胞容受性这两个能明显增强HCV体外复制能力的重要因素的发现，拓展了复制子系统的应用领域，如瞬时复制系统、选择性全长基因组及基础研究和抗病毒药物筛选所需各种新型复制子的构建. 最终，复制子系统将有助于诠释α干扰素抗性的分子基础.  我们就复制子的适应性变异和细胞容受性问题进行综述.

　　1细胞培养适应性变异

　　1.1细胞培养适应性变异区域适应性变异现象［1-2］最初是通过在G418筛选的细胞克隆内复制的HCV RNA序列分析而发现的，在多种情况下，发现一个特定细胞内复制的复制子RNA分子群体内，HCV编码区至少可见一个位点变异，致一个氨基酸替代，而该氨基酸的替代在这个细胞克隆中所有RNA分子间是很保守的，尽管每一个HCV非结构蛋白都可见这种“保守性”变异，它们集中于某些特定的区域. 主要集中区域位于NS5A丝氨酸（该蛋白高度磷酸化所需氨基酸）富集的中心区域，研究显示该区域丝氨酸残基常被替代（S2197， S2201， S2204）［3］，而NS5A高度磷酸化在控制HCV RNA复制过程中起着关键的作用［4］，但迄今尚不清楚NS5A磷酸化的改变如何影响RNA复制. 第二个适应性变异集中区域发生于NS3丝氨酸蛋白酶区域的羧基端及NS3螺旋酶的氨基端［3,5］，三维结构显示大多数变异位于溶媒可接近的分子表面，在螺旋酶区域内，变异似乎限于一个特定的表面，研究显示HCV NS3螺旋酶的RNA解链活性是RNA复制所必须的［6］，而该区域的变异对复制功能的影响需进一步研究. 第三个适应性变异集中区域见于NS4B的两个非常独特的位点［3,7］，基于NS4B的拓扑模型，在K1846T位氨基酸发生替代的情况下，这两个位点位于与透膜区2和3连接的胞质环上，在1897位氨基酸发生替代的情况下，则位于透膜区4的胞质羧基端，在MT2C传代HCV基因组复制子中［7］，还发现1897位苯丙氨酸替代缬氨酸，这个基因组是HCV感染MT2细胞克隆的共有序列并经历了多次传代，表明同样的细胞培养适应性变异发生于不同的HCV分离株. 最近，对长期细胞培养（12~18 mo）中，HCV复制子的基因变异及复制动力学研究发现，复制子的基因变异呈现时间依赖性的累积，变异率约为每年每个位点3.0×10-3碱基替代，复制子的基因离散度（diversity）也随时间扩大，来自不同时间点的复制子RNA转染Huh7细胞揭示随时间累积的基因变异明显改善克隆形成效率［8］.
 
　　1.2适应性变异对HCV复制的影响最初，将一些细胞培养适应性变异插入亲代复制子中，定量转染后测定G418抗性集落的数量，发现特定区域变异的插入致集落形成效率增加，NS5A区某些变异的插入，集落形成效率较亲代增加1×104倍［1］. 功能性筛选检测发现高效率的复制子常有多个位点发生适应性变异. 目前，有4个HCV分离株的复制子系统即：Con1［9］，HCV N［10］，H77［1］及JFH1［11］序列. HCV N 与JFH1 序列不需要适应性变异即能在Huh7细胞中有效复制，实验证明NS5A区4个氨基酸（SSYN）的插入与HCV N 序列的有效复制有关. H77序列复制子至少需要两个适应性变异［1,5］，S2204I， A1226D或 P1496L，含有P1496L及S2204I的复制子较仅含有S2204L复制子的复制效率高3×104倍，而含有A1226D及S2204I的复制子较仅含有S2204L复制子的复制效率高800倍；仅含有P1496L复制子较含有P1496L及S2204I的复制子的复制效率低250倍，表明P1496L联合S2204I适应性变异是有效的H77复制子复制所必需的. Con1复制子的适应性变异研究较深入，发现了一系列的适应性变异位点［2,3］，其中，NS5B区R2884G适应性变异效率最高. 在Con1复制子的研究中还证明了复制子的高水平复制无细胞毒性作用. 此外，Lohmann等［3］发现两个高度适应性变异位点的组合使复制子的复制能力明显下降. 实验显示，与不含适应性变异的复制子比较，NS4B区P1936S变异复制能力增加12倍，NS5A区E2163G变异复制能力增加60倍，NS5B区R2884G变异的复制能力增加500倍，而NS4B加NS5B区联合变异，其复制能力仅增加20倍，NS5A加NS5B区联合变异则未见克隆集落的形成. 因此，这些变异可能具有性质相反的作用（incompatibility）. NS3区变异总是与NS4B， NS5A， NS5B区至少1个变异相关，NS4B，NS5A或NS5B区单个变异赋予细胞培养的适应性机制似乎不同于NS3区的变异. 由上可见，适应性变异可发生于所有HCV非结构蛋白区域，根据其对复制效率及协同性的影响，适应性变异至少可分为两组： ①  NS3 区变异：对复制效率影响小，但与高度适应性变异联合，可协同增加复制效率；②  NS4B，NS5A，NS5B区变异：对复制效率有明显的增强作用，但相互之间联合可引起复制效率降低. 此外，有人［12］构建了一个含有1b NS35A骨架和2b NS5B的嵌合性1b:2b复制子，仅在NS5B区含有一个新的适应性变异，即能在Huh7细胞中有效复制.
 
　　1.3适应性变异增加RNA复制效率的机制目前尚不清楚. 根据一些实验结果显示，NS3和NS5B区的替代常常位于分子的表面及远离各个酶活性中心，推测细胞适应性变异主要是直接或间接地影响了复制子与宿主细胞因素的相互作用［13］.

　　1.4细胞培养适应性变异对体内感染性的影响在细胞培养适应性变异的研究中发现病毒基因的体内感染性与体外复制能力明显不一致［1,9,10,14］. HCV Con1亲代基因（不含适应性变异的分离株）肝内接种黑猩猩1 wk后，动物即出现病毒血症，随后为持续性感染，平均病毒滴度达1×108 mEq/L，但其复制子的复制能力很弱，而在该基因的NS3区引入2个适应性变异（E1202G,  T1280I）及NS5A区引入1个适应性变异（S2197P）的子代基因则完全丧失了体内感染性，但体外复制能力明显增强，如果仅在NS5A区引入1个适应性变异，动物可被该子代基因感染，只是感染时间延后1 wk，而该基因复制子的复制能力较前者为弱. 与上述观察相一致的是，HCVN分离株体内感染性很弱，但其复制子即使缺乏细胞适应性变异在Huh7细胞中的复制效率也较强，这是由于在NS5A中心区有4个氨基酸的插入而赋予了该分子的适应性表型及体内耐受. 另一个国际上知名的HCV序列H77分离株具有很强的体内感染性，但其复制子的构建则经历了相当困难的过程，在H77序列的NS5A区引入了一个适应性变异及NS3区引入了一个协同变异且采用了高度容受性的Huh7.5细胞系后，H77复制子才构建成功. 最近，Sarrazin等［15］对26名慢性HCV 1型感染患者的病毒基因NS3区和NS4BNS5B区含常见的31个复制子适应性变异位点的序列进行了研究，共发现5例患者分别在NS3区存在特异性变异（P1112R， R1283G和S1496M），该变异与基线HCV RNA载量无关，但与干扰素过程中RNA浓度缓慢下降有关.

　　2宿主细胞容受性

　　宿主细胞容受性是指体外培养细胞支持HCV复制的能力. 采用瞬时复制检测系统，发现同一Huh7细胞系不同传代细胞之间RNA复制水平可相差100倍以上，这种差异与引入复制子的适应性变异无关且在亲代HCV Con1 RNA也可见这种现象［3］. 然而，宿主细胞容受性的水平难以控制且其变化也不可预测. 在细胞容受性有关因素的研究中，发现IRES依赖性HCV RNA翻译过程及RNA稳定性方面的因素与此无关. 这样，一个解释可能是细胞容受性水平由RNA复制所需的某些宿主细胞因素的量及活性决定，支持该推测的证据是实验中发现复制效率随着转染Huh7细胞的复制子RNA量的增加而降低，说明Huh7细胞中某些因素限制了RNA的复制. 另一证据是有研究发现有效的HCV RNA复制仅发生于Huh7细胞的一个亚群，推测非适应性的HCV复制子转染后G418抗性集落形成的数量减少，不仅决定于引入的适应性变异的频率还决定于特定宿主细胞的容受性，G418筛选后获得的细胞克隆会含有细胞培养适应性复制子和/或是选择出的具较高水平容受性的细胞亚群，实验也证明了这个假设［16］，用α干扰素或能有效阻断复制子RNA增殖的选择性抑制剂处理携带稳定复制HCV RNA的Huh7细胞克隆，约2 wk后，大多数HCV RNA分子被清除，产生了一群所谓的“cured”细胞，用选择性复制子再转染这些细胞，与未转染过HCV RNA的Huh7细胞（nave）比较而言，G418抗性集落的数量明显增多，表明在G418处理过程中，具有较高容受性 的Huh7细胞被选择出来了. 然而，由于容受性不是一种稳定的表型，且用于比较的“nave”细胞也会发生变化，故“cured”细胞与“nave”细胞间容受性的差异是难以制备的，如实验显示“cured”细胞较“nave”细胞第8代或第37代有更高的容受性，而较第128代或142代的容受性低，同时显示“cured”细胞容受性也不具有稳定的特性.

 
　　Zhu等［17］根据HCV具有准种的特性，想象到病毒群可能含有能够在不同细胞类型及不同种系中复制的变异株，且细胞培养适应性变异可能扩大HCV的宿主细胞范围，探讨了HCV在肝外组织及非灵长类细胞中复制的可能性，发现亚基因组HCV复制子能够在小鼠肝癌细胞系及人类上皮细胞（HeLa）中复制，从这种复制子细胞中分离的复制子含有一些新的变异，主要集中于NS4B与NS5A区，且发现几个在Huh7复制子中从未出现的适应性变异，表明可能存在细胞类型特异性的适应性变异现象. 该实验同时证明HCV RNA复制并不绝对依赖于肝细胞或灵长类特异性的因素，换言之，影响HCV复制的宿主因素并非是肝细胞及灵长类特异性的.
 
　　综上所述，有关细胞培养适应性变异和宿主细胞容受性的深入研究，对最优化的构建不同基因型传统的复制子或复制子瞬时系统及拓展容受性好的细胞系奠定基础，从而有助于进一步建立能产生感染性病毒颗粒的系统，以便于病毒复制周期的研究，更重要的是宿主细胞系的拓展可排除特定细胞系特异性因素的影响，使采用该模型系统所进行的研究更具可靠性.

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