人可溶性CD40L cDNA的克隆及表达

【关键词】  原核表达

    Cloning of human sCD40L cDNA and construction of vector for expression in E. coli

　　【Abstract】 AIM: To clone human sCD40L(184-831) cDNA and construct a prokaryotic vector for expression in E. coli. METHODS: The human sCD40L(184-831 ) cDNA was amplified with the total RNA from the human tonsil by reverse transcriptase (RT)PCR, and was analyzed by enzymatic digestion and sequencing. Then, the insert of human sCD40L(184-831) cDNA was cloned into the vector pET28a+ for expression in BL21, and then the interest protein was identified by Western blot. RESULTS:  The result of sequencing was accordant with the one reported. The prokaryotic expression vector was constructed successfully and the interest protein was expressed in BL21.  CONCLUSION: The human sCD40L(184-831) cDNA has been successfully cloned and a prokaryotic system been constructed for expression. The interest protein was expressed successfully in BL21.

　　【Keywords】 CD40L; cloning; prokaryotic expression

　　【摘要】 目的: 利用基因技术克隆CD40L分子的胞外区184～831片断cDNA,构建其原核表达载体,从而建立原核表达体系. 方法: 采用RTPCR 方法从人扁桃体的总RNA中扩增CD40L分子184～831片断的cDNA,以限制性酶切和DNA 测序进行鉴定,并将目的片断克隆至原核表达载体pET28a+,让重组质粒在BL21中表达,利用Western blot鉴定目的蛋白. 结果: 克隆到人sCD40L分子184～831片断的cDNA,DNA测序结果与报道的完全一致;构建了该片断的原核表达载体, 且目的蛋白能在BL21中表达. 结论: 成功克隆人sCD40L分子184～831片断的cDNA并构建了其原核表达载体. 在BL21中成功表达了目的蛋白.

　　【关键词】 CD40L; 克隆; 原核表达

　　0引言

　　人CD40L由261个氨基酸残基组成,为典型的Ⅱ型跨膜蛋白, CD40L包括胞浆内区,跨膜疏水区及胞浆外区组成,其中胞膜外区214个氨基可形成可溶性蛋白,与其膜型分子一样可与B细胞表面的CD40分子交连传递信息,不仅参与体液免疫,而且参与炎症反应,在疾病的发病机制和临床中具有重要作用［1］.在本文中,利用反转录聚合酶链反应从人扁桃体组织总RNA中扩增出人CD40L基因胞外区47～261氨基酸残基的cDNA序列. 并利用原核表达载体构建了其重组表达质粒,为该序列蛋白质的进一步的功能研究奠定了基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料所用的人扁桃体组织是由西南耳鼻喉科提供,pUC19质粒pET28a+质粒DH5α菌种和BL21菌种是由第三军医大学生化与分子生物学教研室保存.限制性内切酶BamH I,Pst I购自大连宝生物公司;Tripure总RNA抽提试剂盒等购自Roche公司;RT2PCR试剂盒购自Promege公司, PCR产物回收纯化试剂盒购自天为时代公司.用液氮罐把新鲜的扁桃体组织从西南医院取回,按Roche公司Tripure试剂盒操作指南从培养细胞中提取细胞总RNA.

　　1.2方法

　　1.2.1反转录PCR(RTPCR)扩增184～831片断的CD40L基因,引物根据GenBank库的CD40L cDNA序列设计, 上游引物为: GCGGATCC CATAGAA GGTTGGACAAG,含BamH I酶切位点,下游引物为: GCCTGCAGTCAGAGTTTGAGTAAGCC含PST1酶切位点. (引物由上海生工公司合成)按RT2PCR 试剂盒说明进行,其扩增参数为:50 μL总反应体积,2 μL抽提的总RNA为模板, 48℃反转录45 min, 94℃变性2 min; 然后以94℃，30 s, 60℃，1 min,68℃，2 min的程序循环35次,68℃延伸10 min. 在PCR仪上进行扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,扩增基因片断预期为648 bp.

　　1.2.2重组质粒pUC19的构建和鉴定将PCR产物及pUC18质粒经酶切后用纯化试剂盒回收,以T4 DNA连接酶4℃连接16 h, 常规氯化钙法转化DH5α,α2互补筛选, 经碱裂法提取质粒,用限制性酶切分析和DNA序列测定进行了鉴定(序列测定由上海生工公司完成).

　　1.2.3原核表达载体的构建大量扩增、抽提鉴定过的重组质粒,用限制性内切酶消化, 经琼脂糖凝胶电泳回收相应片断,再将该片断连接于pET28a+表达载体,转化BL21菌种后,小量提取质粒,以限制性酶切进行鉴定.

　　1.2.4sCD40L的表达及鉴定经过酶切鉴定阳性的pET28a+sCD40L克隆在IPTG的诱导下表达sCD40L,用SDSPAGE蛋白电泳检测蛋白的表达, 用his抗体进行Western blot鉴定目的蛋白.

　　2结果

　　2.1RTPCR以人扁桃体组织提取总RNA,以总RNA为模板, RTPCR扩增出一特R异性条带,位置相当于648 bp,与预期的大小一致(图1).

　　1:Marker；2,3: PCR反应物.

　　图1RTPCR图（略）

　　2.2PCR产物克隆及重组质粒序列测定分别用限制性内切酶BamH I,Pst I消化PCR产物和pUC19质粒,以T4 DNA连接酶连接后,转化感受态E. coli DH5α,经α2互补筛选出白色菌落,再用限制性酶切鉴定,得到的重组子进行DNA序列测定， 酶切鉴定(图2).

　　1:Marker；6,12:阴性重组子; 其余:阳性重组子.

　　图2pUC19sCD40L酶切鉴定图（略）

　　2.3原核表达质粒的构建对经序列测定确证的重组质粒DNA用BamH I,Pst I双酶切,经琼脂糖电泳回收目的片断,然后将其定向克隆至新型原核表达载体pET28a+,用限制性酶切方法鉴定重组子. 结果获得了预期大小的DNA片断(图3).

　　1: 1 kb plus marker; 2,4,6:pET28a+酶切; 3,5,7:pET28a+sCD40.

　　图3pET28a+sCD40L酶切鉴定（略）

　　2.4sCD40L的表达及鉴定经过酶切鉴定阳性的pET28a+sCD40L克隆在IPTG的诱导下表达sCD40L,用SDSPAGE蛋白电泳检测蛋白的表达(图4),由于pET28a+带有his标签,所以表达的蛋白尾端带有多聚组氨酸,用his抗体进行Western blot鉴定目的蛋白(图5).

　　1:Marker;  2:不含有质粒的BL21蛋白表达; 3:含重组质粒但未诱导BL21蛋白表达; 4:含重组质粒诱导后BL21蛋白表达，约在Mr 30×103处有目的蛋白.

　　图4sCD40L的SDSPAGE电泳（略）

　　3讨论

　　CD40配体(CD40L),即CD154, gp39,肿瘤坏死因子相关激活蛋白(TNF associated activation protein, TRAP), T细胞B细胞活化分子(T cellB cellactivating molecule, TBAM)，一种与TNF家族同源的膜蛋白［2］, 不仅存在于CD4+T细胞表面,而且在其他细胞表面也发现有表达,其表达受多种因素调节.CD40L的膜结合型与sCD40L均具有活性,且均以同源性三聚体形式存在［2］.CD40L首先在激活的CD4+T细胞发现,随后发现在肥大细胞,杀伤细胞都有表达. 现在研究认为动脉粥样硬化是一种炎症反应性疾病,在动脉粥样硬化的炎症反应中,CD40L参与了炎症反应的全过程.CD40L不仅在炎症初期诱导产生VCAM1引发炎症,而且还会在炎症中期诱导巨噬细胞产生组织因子加重炎症,其中诱导巨噬细胞产生的metalloproteinase1会进一步损害血管壁［3］.所以抑制CD40L的功能会抑制动脉粥样硬化的血管壁损害［4］，CD40L也被认为是动脉粥样硬化发生、的关键分子.

　　1:小分子蛋白Marker;  2:目的蛋白.

　　图5Western blot鉴定sCD40L蛋白（略）

　　研究发现,CD40L与CD40相互作用不仅在体液免疫中起作用,而且发现可促进抗原提呈细胞的成熟,上调ICAM1,CD80和CD86的表达,以及促进IL12的分泌,从而增强CD8+CTL的应答,在细胞免疫中发挥重要作用.另外,近来发现CD40L与CD40相互作用可诱导单核细胞产生白细胞介素1以及TNFα等炎症因子,抑制单核细胞和淋巴细胞调亡,从而在动脉粥样硬化的炎症反应中起重要作用［5］.因此,CD40L在基础免疫和临床疾病研究中有重要的应用价值.

　　在本研究中,通过RTPCR的方法从人扁桃体组织中成功地克隆出人CD40L分子胞外区184～831 氨基酸残基的cDNA 片断,并通过序列分析加以确证,还构建了原核表达体系,为后续基因工程研究奠定了基础. 在所建立的表达体系中,采用了原核表达载体pET28a+质粒,并在原核细胞中成功表达.由于所选的载体pET28a+末端带有his标签,因此纯化时,选用能与his结合的镍离子亲和层析柱,获得纯度较高的表达蛋白,为进一步制备sCD40L抗体,研究动脉粥样硬化的发生奠定了坚实的基础.

　　【】

　　［1］ Mulhaupt F, Matter CM, Kwak BR,et al. Statins (HMGCoA  reductase inhibitors) reduce CD40 expression in human vascular cells ［J］.Cardiovasc Res, 2003,59(3):755-766.

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　　［3］ Pillarisetti S, Alexander CW, Saxena U. Atherosclerosis-new targets and therapeutics ［J］. Curr Med Chem Cardiovasc Hematol Agents, 2004, 2:327-334.

　　［4］ Elkind MS, Rundek T, Sciacca RR, et al. Interleukin2 levels are associated with carotid artery intimamedia thickness ［J］. Clin Invest, 2001, 107: 1255-1262.

　　［5］ Lawson C, Ainsworth ME, McCormack AM,et al. Effect of crosslinking ICAM1 on the surface of human vascular smooth muscle cells induction of VCAM1 but no proliferation ［J］.Cardiovasc Res,2001,50(3):547-555.