缺血预处理对大鼠缺血再灌注小肠能量代谢、Bcl
【关键词】 缺血预处理
Effect of ischemic preconditioning on energy metabolism and expressions of Bcl2 and Bax in ischemia/reperfusion of rat small intestine
【Abstract】 AIM: To study the effect of ischemic preconditioning on cell apoptosis following acute intestinal ischemia/reperfusion in rats and explore their relationship. METHODS：Thirtysix SD rats were randomized into 3 groups each consisting of 12 rats: shamoperated control group(C group), ischemic reperfusion group(I/R group, the anterior mesenteric artery occlusion for 60 min followed by reperfusion for 120 min ), ischemic preconditioning group (IPCI/R, clamping the anterior mesenteric artery for 10 min followed by unclamping it for 10 min, all for 4 times before I/R). Immunohistochemistry was used to detect the expressions of Bcl2 and Bax. Twentyfour fields of vision were selected in each group to determine A value. TUNEL method was applied to detect apoptotic intestinal cells, and to calculate the apoptotic index. RESULTS：The contents of ATP in C and IPCI/R groups were significantly higher than that in I/R group (P<0.05)；the A value of Bcl2 in I/R group was remarkably lower than that in C group (P<0.05), and the A value of Bcl2 in IPCI/R group was obviously higher than those in C and I/R groups (P<0.01); the A value of Bax in I/R group was significantly higher than those in C and IPCI/R groups(P<0.01), and the A value of Bax in IPCI/R group was remarkably higher than that in C group (P<0.05). Compared with that in C group, the apoptotic indexes in I/R and IPCI/R group were significantly higher (P<0.01 and P<0.05); Compared with that in I/R group, the apoptotic index in IPCI/R group was significantly lower (P<0.01). CONCLUSION：Ischemic preconditioning can curb ATP degeneration,enhance the expression of Bcl2, decrease the expression of Bax, inhibit the apoptosis following small intestinal ischemic reperfusion.
【Keywords】 small intestine; preconditioning; ischemic reperfusion; apoptosis; gene
【摘要】 目的：探讨缺血预处理对小肠细胞能量代谢和凋亡基因bcl2，bax表达的影响及它们与肠细胞凋亡的内在联系. 方法：健康SD大鼠36只，雌雄不限，随机分为3组，空白对照组（C组）、缺血预处理组（IPCI/R组）和缺血再灌注组（I/R组），每组12只. 按Murry法制备缺血预处理模型，I/R组用血管钳夹闭肠系膜前动脉1 h，再灌注2 h, IPI/R组用血管钳夹闭肠系膜前动脉10 min松开10 min，反复4次，余同I/R组. 高效液相色谱法测定ATP，ADP含量；免疫组化检测Bcl2及Bax蛋白的表达，每组选24个视野分别测量A值. TUNEL法检测凋亡的小肠细胞并凋亡指数. 结果：C和IPCI/R组ATP含量高于I/R组（P<0.05）； IPCI/R组Bcl2 A值高于C组和I/R组（P<0.01），I/R组Bcl2 A值低于C组（P<0.05）；I/R组Bax A值明显高于C组和IPCI/R组（P<0.01），且IPCI/R组高于C组（P<0.05）；与C组比较，I/R组和IPCI/R组凋亡指数较高（P<0.01, P<0.05）;与I/R组相比，IPCI/R组凋亡指数较低（P<0.01）. 结论：缺血预处理能在一定程度上延缓ATP降解并调控Bcl2及Bax蛋白的表达、抑制缺血再灌注介导的小肠细胞凋亡.
【关键词】 小肠；缺血预处理；缺血再灌注；细胞凋亡；基因
0引言
肠缺血再灌注损伤广泛见于临床，是导致多脏器功能障碍的重要原因. 研究表明，凋亡是其损伤的主要方式，与细胞的能量代谢和凋亡基因的蛋白表达有关. 缺血预处理（ischemic preconditioning, IP）对缺血再灌注小肠有较好的保护作用［1-2］，但它对细胞凋亡的影响研究较少. 我们通过大鼠小肠缺血预处理模型，从细胞凋亡的角度探讨缺血预处理对小肠细胞凋亡基因bcl2和bax表达的影响.
1材料和方法
1.1材料Bcl2 mAb，Bax mAb，SP试剂盒、原位细胞凋亡检测试剂盒（均为Santa Cruz公司产品，USA）；ATP，ADP标准品（Sigma公司，USA）.
1.2方法
1.2.1动物分组与模型制备健康SD大鼠36只(由武汉大学实验动物中心提供)，体质量225~275 g，雌雄不限. 随机分为空白对照组(C组)、缺血再灌注组(I/R组)和缺血预处理组(IPCI/R组). 术前12 h禁食不禁水，20%氨基甲酸乙酯1 g/kg腹腔注射麻醉，腹中线切开，找到肠系膜前动脉，C组不夹闭肠系膜前动脉；I/R组用血管钳夹闭肠系膜前动脉1 h，再灌注2 h，IPCI/R组依据Wu等［3］方法，用血管夹夹闭肠系膜前动脉10 min,松开10 min，反复4次，余同I/R组. 三组均于手术开始时分别经股静脉输注生理盐水20 μL/g，手术过程中均面罩给氧（FiO2=33％），术毕放血处死，距回盲部20 cm取回肠组织2 cm，用现配多聚甲醛液固定24 h，做Bcl2和Bax蛋白的表达及细胞凋亡检测.
1.2.2观察指标及方法①小肠组织ATP，ADP含量：各组距回盲部20 cm取回肠组织0.5 g置液氮保存，用高效液相色谱法测定ATP，ADP含量. ②免疫组化检测bcl2及bax基因的表达（SP法）：石蜡切片脱腊至水；30 mL/L H2O2孵育10 min以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，PBS浸洗5 min；加正常山羊血清封闭液以消除背景非特异性染色；分别滴加兔抗Bax，Bcl2，cmyc蛋白mAb/pAb（每张切片仅加一种抗体），37℃孵育1 h；滴加生物素标记羊抗兔IgG，37℃孵育15 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育15 min；上述三步均PBS洗5 min×3次；DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，封片. 阴性对照以PBS代替一抗孵育，其他步骤相同；阳性对照用已知的阳性标本. 在显微镜400倍下用HPIAS1000医学彩色图像分析系统测量A值，每组选24个视野（每组12只大鼠各取1张切片，每张切片取2个视野）分别测量，计算A值的均数作为此组的代表值；③TUNEL法检测凋亡细胞：二甲苯脱蜡，梯度乙醇入水；切片浸泡于柠檬酸盐缓冲液（pH=6），置医用微波炉92~98℃中处理15 min，取出后室温冷却；1∶5小牛血清20 μL封闭非特异反应，37℃孵育15 min；3 mL/L H2O2孵育10 min以消除内源性过氧化物酶的活性；POD 20 μL 37℃孵育30 min；上述5步均以10 mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）洗5 min×3次；DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，封片. 每张切片于40倍目镜下随机取5个视野，每组共60个视野，计算凋亡指数(apoptotic index, AI), AI=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%.
统计学处理： 计量资料以x±s表示，应用SPSS 10. 0软件进行单因素方差分析， P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1ATP，ADP含量C组和IPCI/R组ATP含量高于I/R组（P<0.05），ADP含量各组无显著性差异(表1).
2.2Bcl2和Bax蛋白表达I/R组Bcl2 A值低于C组（P<0.05），IPCI/R组Bcl2 A值高于C组和I/R组（P<0.01）； Bax A值，I/R组明显高于C组和IPCI/R组（P<0.01），且IPCI/R组高于C组（P<0.05，表1）.
2.3TUNEL法检测小肠细胞凋亡与C组比较，I/R组和IPCI/R组AI较高（P<0.01,P<0.05），与I/R组相比， IPCI/R组AI较低（P<0.01，表1）.
表1三组ATP，ADP含量(μmol/g湿质量）,Bcl2，Bax蛋白表达及AI的比较（略）
aP<0.05, bP<0.01 vs C组; cP<0.05, dP<0.01 vs I/R组. C：对照组；I/R：缺血再灌注组；IPCI/R：缺血预处理组；ATP：三磷酸腺苷；ADP：二磷酸腺苷；AI：凋亡指数.
2.4三组TUNEL凋亡细胞、Bax及Bcl2阳性细胞表达情况见图1~3.
A: 有较少的Bcl2阳性细胞表达; B: 有较少的Bax阳性细胞表达; C: 有较少的凋亡细胞阳性表达.
图1对照组Bcl2, Bax及TUNEL凋亡细胞阳性表达IH ×200（略）
3讨论
肠I/R可因急性失血、休克、严重多发性创伤等因素引起，它可引起肠道和导致远端器官的损伤. IP可通过增加谷胱甘肽含量和保护SOD活性［4］、减少细菌异位和降低iNOS活性［2］、蛋白激酶C和线粒体K(ATP)通道开放［5］以及血红素加氧酶1释放［6］等多种途径保护缺血再灌注小肠，其保护作用的机制尚未完全阐明，目前认为细胞的能量代谢和凋亡也可能占有重要地位. 我们采用血管夹夹闭肠系膜前动脉A: 有较少的Bcl2阳性细胞表达; B: 有较多的Bax阳性细胞表达; C: 有较多的凋亡细胞阳性表达.
图2缺血再灌注组Bcl2, Bax及TUNEL凋亡细胞阳性表达IH ×200（略）
A: 有较多的Bcl2阳性细胞表达，表现为间质细胞呈淡黄色连续的细颗粒状; B: 有较少的Bax阳性细胞表达; C: 有较少的凋亡细胞阳性表达,表现为小肠细胞胞核有不均匀的黄褐色颗粒，胞浆复染为淡蓝色.
图3缺血预处理组Bcl2, Bax及TUNEL细胞阳性表达IH ×200（略）
复制肠I/R和IP模型，结果显示，肠I/R后，小肠组织的ATP含量和Bcl2蛋白表达均降低， Bax蛋白表达及AI显著增加；而IP后肠I/R，ATP含量和Bcl2蛋白表达增加，Bax蛋白表达及AI降低，提示凋亡及其相关因素参与了缺血再灌注损伤，IP对缺血再灌注损伤有保护作用.
线粒体是细胞重要的细胞器之一，它除了产生ATP供能外，在细胞氧化还原状态和渗透压调节、钙稳态和pH维持以及细胞信号转导中起重要作用. 细胞无论坏死或凋亡线粒体都要经历诱导、效应、降解阶段. ATP对线粒体通透性转换后细胞走向坏死还是凋亡有重要意义， ATP耗竭走向坏死，否则走向凋亡. 研究表明［7］，IP后，组织可产生“缺血、再灌注耐受”，需能和代谢降低，氧自由基、活化中性粒细胞释放和细胞凋亡减少. 我们研究发现，肠缺血再灌注后，AI显著增加可能与ATP含量降低有关；而IP后，ATP含量变化不大，可能与能量需要和代谢降低有关.
Bcl2表达水平与细胞寿命呈正相关，因此Bcl2又称为“生存基因”. Bax属Bcl2基因家族，在高浓度时可启动细胞死亡，低浓度时可使细胞器释放出某些分子，引起半胱氨酸蛋白酶的活化. Bcl2基因家族通常以二聚体的形式发挥作用，Bax/Bcl2异二聚体可促进细胞凋亡，而Bcl2/Bcl2同二聚体可结合于线粒体内膜稳定其通透性，以防止细胞凋亡的末端效应子半胱氨酸蛋白酶(Caspases)的激活. 我们实验发现：I/R组Bax蛋白表达明显高于C组和IPCI/R组，与肠黏膜损伤和AI变化一致，说明缺血再灌注肠细胞凋亡是Bax介导的，且IP能降低缺血再灌注肠细胞Bax蛋白表达. 而IPCI/R组Bcl2蛋白表达明显高于I/R组和C组，说明I/R在一定程度上可增加Bcl2蛋白表达，与Cinel等［1］报道一致. 总之，尽管IP可通过多种途径保护缺血再灌注小肠，但部分可能与减少ATP降解、增加Bcl2蛋白表达和降低Bax蛋白表达有关，其具体机制有待进一步研究.
【】
［1］ Cinel I,Avlan D,Cinel L,et al.Ischemia preconditioning reduce intestinal epithelial apoptosis in rats［J］.Shock,2003,19（6）:588-592.
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