肝癌细胞HepG2与肝癌患者树突状细胞融合瘤苗的体外效应

                                 作者：　张红梅，张利旺，刘文超，潘伯荣，斯晓明，任军

【关键词】  细胞融合

    Effect of a vaccine prepared by fusion of HepG2 cells with dendritic cells from patients with hepatocellular carcinoma in vitro

　　【Abstract】  AIM: To investigate the fusion ability of  hepatocellular carcinoma (HCC) patientderived dendritic cells (DCs) with HCC cells (HepG2) in inducing autologous T lymphocytes to elicit specific immunity against HCC in vitro. METHODS:  Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from HCC patients were isolated by blood separator. In the presence of recombinant human granulocyte/macrophageclone stimulating factor (rhGMCSF) and interleukin4 (rhIL4), PBMCs were cultured in vitro for 1 week to induce DCs. The expression of cell surface molecules was assessed by flow cytometry. The fusion cells of DCs with HepG2 cells (DCs/HepG2) were achieved by polyethylene glycol (PEG). The ability of DCs/HepG2 to stimulate the proliferation of autologous T lymphocytes was evaluated by MTT assay and the specific lysis of HepG2 by DCs/HepG2 induced cytotoxic T lymphocytes (CTLs) was detected by cytotoxicity test. RESULTS:  After fusion, DCs/HepG2 highly expressed surface molecules, including CD83 90.4%, CD80 87.7%, CD86 84.4% and HLADR 98.5%. The fusion cells had a remarkably greater ability to stimulate the proliferation of autologous T lymphocytes in comparison with HepG2 and DCs. The DCs/HepG2activated CTLs showed a potent specific lysis to HepG2 cells, which was (63.5±4.6)% with an effectortarget ratio 20∶1. CONCLUSION:  The fusion of DCs derived from HCC patients with HepG2 cells can effectively stimulate autologous T lymphocytes to elicit specific antitumor immunity against HCC and may serve as a promising vaccine for immunotherapy of HCC.

　　【Keywords】 dendritic cells; cell fusion;  carcinoma, hepatocellular; immunotherapy

　　【摘要】 目的： 将肝细胞癌（HCC）患者树突状细胞(DCs)与肝癌细胞HepG2融合制备瘤苗，检测其体外诱导同源T细胞产生特异性抗HepG2的免疫效应. 方法： 以血细胞分离机分离富集HCC患者外周血单个核细胞（PBMCs），应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)、白细胞介素4(rhlL4)体外诱导培养DCs；聚乙二醇融合DCs与肝癌细胞HepG2, MTT法测定融合细胞(DCs/HepG2)刺激同源T淋巴细胞增殖分化能力，细胞毒性实验检测DCs／HepG2诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HepG2的特异性杀伤作用. 结果： 融合细胞DCs/HepG2高表达成熟DC表面分子，其中CD83 90.4%, CD80 87.7%, CD86 84.4%, HLADR 98.5%；其刺激同源T淋巴细胞增殖的能力显著高于HepG2和DCs；DCs/HepG2活化的CTL对HepG2具有显著杀伤作用，其杀伤率为(63.5±4.6)%（效靶比例为20∶1）. 结论： HCC患者外周血DC融合HepG2细胞可有效诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗HCC免疫效应，可能成为HCC免疫的有效途径.

　　【关键词】 树突细胞；细胞融合；癌，肝细胞；免疫疗法
　
　　0引言

　　肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）因缺乏特异性肿瘤抗原且抗原性弱，其生物治疗相对困难. 树突状细胞(dendritic cells, DCs)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞，可摄取、加工处理和提呈抗原，并有效激活T细胞产生抗原特异性免疫应答［1］. 将DC与肝癌细胞融合，理论上可实现DC对肝癌细胞抗原最充分的提呈，有望获得令人满意的肝癌生物治疗效果. 我们利用细胞融合技术将DC与肝癌细胞融合，制备融合细胞疫苗，探讨其生物学特性及抗肿瘤活性，为肝癌DC疫苗临床应用提供实验基础及相关资料.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　RPMI1640培养液、T细胞尼龙毛柱购自美国Gibco公司；Xvivo15无血清培养液购自美国Cambrex Bioscience公司；淋巴细胞分离液、细胞膜荧光染料PKH26，PKH67，500g/L聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)为美国Sigma公司产品；重组人GMCSF，IL4为美国PeproTech公司产品；新型重组人肿瘤坏死因子nrhTNF购自第四军医大学生物技术中心；ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司；抗人FITCCD80, HLADR mAb与抗人PECD86, CD83 mAb均为美国BD PharMingen公司产品.
 
　　1.2方法

　　以血细胞分离机分离富集HCC患者外周血单个核细胞（PBMCs），淋巴细胞分离液密度梯度离心纯化，无血清Xvivo15培养液重悬细胞，置于24孔聚苯乙烯培养板，贴壁法移去悬浮细胞，贴壁细胞加入rhGMCSF（终浓度100 μg/L）, rhIL4（终浓度10 μg/L），于37℃, 50 mL/L CO2条件下培养5 d，补加上述细胞因子，7 d收获DCs. 上述悬浮细胞采用尼龙毛柱分离法分离T细胞，于含IL2（终浓度20 kU/L）的无血清培养液Xvivo15中培养. 人肝癌细胞HepG2和白血病细胞K562为我室保留株，于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中常规培养. HepG2细胞（经30 Gy γ射线照射）与DCs分别以红色荧光染料PKH26和绿色荧光染料PKH67染色（染色过程按产品说明书进行），1∶3比例混合，37℃水浴中缓慢加入预热的PEG+DMSO, 90 s内完成，加入10倍体积RPMI1640终止反应；离心后细胞重悬于Xvivo15培养液中，加入前述细胞因子并补加1 kU nrhTNFα（终浓度为1 MU/L），37℃, 50 mL/L CO2培养24 h，收集贴壁生长细胞，倒置显微镜、荧光显微镜观察细胞形态. 以PECD80, CD83, FITCCD8, HLADR mAb标记DCs，具体方法： 分别收集融合前DCs，融合细胞（未经荧光染料标记），调整细胞密度5×109/L，各取50 μL，加入1∶20灭活兔血清10 μL, 4℃封闭10 min，分别加入上述mAb, 4℃避光30 min后，PBS洗2次，流式细胞仪检测；同时检测HepG2细胞（PKH26）与DCs（PKH67）融合效率.
 
　　1.2.1DC融合细胞IL12分泌测定融合24 h后收集培养上清，ELISA法测定上清中IL12含量（按说明书操作），以未融合DCs和HepG2细胞为对照，每组设6复孔.
 
　　1.2.2DC融合细胞刺激自体T淋巴细胞增殖实验将融合细胞、DCs（30Gy γ射线照射）分别与T细胞（1×109/L）以1∶10，1∶30，1∶100比例混合，于96孔板培养5 d，每组设3复孔，MTT显色法于波长490nm处检测吸光度（A）值，T细胞增殖以刺激指数（SI）表示，SI=刺激细胞孔A490值/不加刺激细胞孔A490值.
 
　　1.2.3DC融合瘤苗诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应T细胞（1×109/L）分别与DCs/HepG2融合瘤苗, DCs, HepG2 （1×108/L）在IL2条件下（20 kU/L）共培养5 d，收集效应T细胞，调节细胞密度l×108/L，与HepG2（1×107/L）共培养24 h后，ELISA法测定培养上清中IFNγ含量（按说明书操作）；另收集上述效应T细胞，调节细胞密度2×108/L，分别与HepG2 （1×107/L）, K562 （1×107/L）共培养24 h, MTT法测定效应T细胞对HepG2, K562的细胞毒性，其杀伤率(%)=［1-（A实验孔-A效应细胞对照孔）/A靶细胞对照孔］×l00.

　　统计学方法： 结果以x±s表示，采用t检验（SPSS11.0）, P<0.05认为有统计学差异.

　　2结果

　　倒置显微镜下，DCs体积较大，可见典型树枝状突起；HepG2细胞略小，贴壁生长；融合后可见典型双核细胞（图1）. 诱导d 7, DCs表达CD80 22.6%, CD86 13.5%, HLADR 32.4%, CD83低表达，仅0.34%；与HepG2融合后，上述分子表达明显升高，分别为CD80 87.7%, CD86 84.4%, HLADR 98.5%, CD83 90.4%，提示融合细胞具有成熟DC特征. 荧光显微镜下检测DCs/HepG2细胞融合率约为30%；流式细胞仪检测融合细胞（PKH26与PKH67双阳性）约占38.2%.

　　2.1IL12分泌融合24 h后，DCs/HepG2融合细胞、单纯DCs及单纯HepG2细胞分泌IL12分别为（386.2±31.8）, （71.1±38.6）, （13.2±5.2） ng/L，融合细胞组分泌IL12明显高于单纯DCs及单纯HepG2组（n=6, P<0.01）.

　　2.2T细胞增殖以未加刺激细胞组作为空白对照，DCs/HepG2融合细胞致敏的T细胞增殖明显，在各浓度的刺激指数（SI）均显著高于DCs组及HepG2组(n=3, P<0.01，图2）.

　　2.3CTL效应ELISA结果显示DCs/HepG2，单纯DCs及单纯HepG2刺激的T细胞与HepG2共培养24 h后，上清中INFγ含量分别为（273.3±70.7）, （142.6±39.2）, （92.0±22.2） ng/L, DCs/HepG2组明显高于对照组(n=3, P<0.01). 同时，DCs/HepG2融合瘤苗刺激的T细胞对HepG2细胞杀伤率均明显高于对照组（n=3, P<0.05）; DCs/HepG2, DCs或HepG2刺激的T细胞对非肝癌细胞K562均无明显杀伤活性，提示DCs/HepG2融合瘤苗可有效诱导产生HepG2特异性CTL.

　　3讨论

　　原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，其中90%为HCC，手术切除是目前唯一可能根治的疗法，但术后5 a复发率高达40%~60%，复发转移已成为HCC患者长期生存的主要障碍［2］. 肿瘤疫苗具有激活免疫系统、诱导特异性CTL杀伤肿瘤细胞的功能，可用于预防HCC术后复发转移. 作为肿瘤疫苗研究热点之一的DC，是目前已知功能最强的抗原提呈细胞，高水平表达抗原提呈过程必需的MHC抗原、共刺激分子，可获取、加工肿瘤抗原，将其呈递至T淋巴细胞，诱导产生肿瘤抗原特异性CD4+和CD8+效应T细胞. 目前已报道多种DC疫苗制备策略，主要包括将肿瘤相关抗原基因导入DC［3-4］，应用合成抗原肽、肿瘤抗原提取物、抗独特型抗体或细胞性肿瘤抗原致敏DC［5-6］等. 但多数肿瘤的相关抗原并不明确，且有效的T细胞免疫应答需针对不同肿瘤抗原的多个T细胞克隆协同作用. 因此，以单一肿瘤抗原刺激DC进行免疫，一方面特异性肿瘤抗原难以获取，另一方面未必激活有效的CTL，且技术条件要求较高，不宜临床推广. 而DC与肿瘤细胞融合策略［7］，理论上可将全部肿瘤抗原结合于DC，使其既具有肿瘤细胞的全部抗原性，通过DC抗原提呈功能为MHCI类分子复合体提供连续的内源性肿瘤抗原［8］，又具有激活T细胞的功能.

　　我们以HCC患者外周血PBMC为来源诱导DC，经rhGMCSF, rhIL4体外培养1 wk后，与肝癌细胞HepG2融合. 流式细胞仪检测显示DC/HepG2融合细胞表达高水平HLADR, CD83, CD80, CD86等成熟DC功能分子，明显高于融合前DC表达上述分子的水平；同时，融合细胞IL12分泌量明显增加，提示细胞融合策略可促进DC成熟，使其获得强大的抗原提呈功能和激活T细胞的能力. 混合淋巴细胞反应证实融合细胞可有效刺激同源T淋巴细胞增殖，显著高于单纯DC和HepG2的刺激能力. 活化T细胞分泌IFNγ的水平可作为细胞毒性效应的检测指标之一，我们采用ELISA法测定DC/HepG2融合细胞致敏T细胞分泌的IFNγ，发现其分泌量显著高于对照组；体外杀伤试验显示融合细胞诱导产生的CTL对HepG2具有显著的特异杀伤作用. 我们的结果表明，HCC患者DC与HCC细胞融合，可有效诱导特异性抗HCC免疫应答，有望成为治疗和预防HCC转移复发的新途径，该方法对未明确特异抗原的肿瘤进行DC主动性免疫治疗也具有很强的实用价值.

　　【】

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