肝癌组织survivin的表达与凋亡，增殖和p53的关系

                                   作者：　惠文涛，南克俊，阮之平，景昭，张群领

【关键词】  肝肿瘤

    Relationships between survivin expression and cancer cell apoptosis, proliferation  and p53 expression in hepatocellular carcinoma

　　【Abstract】 AIM: To investigate the expression of survivin protein and its relationship with cell apoptosis, proliferation and p53 protein expression in primary hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS:  The expressions of survivin, p53 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in 42 cancer tissues, 34 ajacent cirrhosis tissues and 10 normal tissues were assessed by immunohistochemical method and apoptosis was detected by TUNEL method. RESULTS:  Survivin protein was expressed in 30 of the 42 cases of HCC (71.4%) and in 4 of the 34 cases of adjacent cirrhosis tissues (11.8%). Expression of survivin protein was negative in the 10 cases of normal tissues. Survivin protein positive expression rate in HCC was significantly higher than that in adjacent cirrhosis tissues and normal tissues (P<0.001). The increased survivin protein expression in cancer was significantly correlated with the histological grade (P=0.003), p53 protein expression (P=0.008), survival time (P=0.002) and the ratio of proliferative index to apoptotic index (P=0.001), but was not with age, sex, tumor size, clinical stage and local metastasis (P>0.05). CONCLUSION:  There is a marked increased survivin expression in HCC, which may play an important role in breaking the balance between the proliferation and apoptosis of HCC cells. Survivin may promote p53negative HCC cells to obtain an antiapoptosis ability, thereby promoting the development of HCC and partly playing a role in the further malignant transition of tumor cells.

　　【Keywords】 survivin; liver neoplasms; apoptosis; proliferating cell nuclear antigen; genes, p53

　　【摘要】 目的： 研究肝癌survivin的表达与细胞增殖、凋亡以及p53表达的关系. 方法： 应用免疫组化法检测原发性肝癌组织42例、癌旁肝硬化组织34例、正常肝组织10例中survivin, p53,增殖细胞核抗原（PCNA）的表达. 应用TUNEL法检测细胞凋亡. 结果： 在42例肝癌组织中survivin阳性30例（71.4%），显著高于癌旁肝硬化组织（11.8%）和正常肝组织（0%, P<0.001). 肝癌中survivin蛋白的高表达与病理分级（P=0.003），p53蛋白水平（P=0.008）、细胞增殖凋亡比（P=0.001）及患者生存时间（P=0.002）存在显著相关性，而与年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、门脉癌栓（局部转移）无显著相关（P>0.05）. 结论： 肝癌组织survivin高表达在打破肝癌细胞的增生和凋亡之间的平衡中起着重要作用. Survivin 可能抑制p53阴性肝癌细胞的凋亡，在肿瘤细胞的进一步恶性转化中发挥作用.

　　【关键词】 survivin；肝肿瘤；细胞凋亡；增殖细胞核抗原; 基因，p53

　　0引言
 
　　肝癌中存在增殖与凋亡平衡失调，决定着肝癌细胞的增生速率. Survivin在多种恶性肿瘤组织中高表达，包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌［1-2］. p53是一个经典的抑癌基因，在肝癌中p53的突变率高达55.1%［3］. 我们采用免疫组化和原位末端标记法（TUNEL）检测survivin，p53在肝癌组织中的表达，并探讨survivin与细胞凋亡、细胞增殖、p53的相关性及其临床病意义.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　西安大学第一200002/200211手术切除经病理学证实的肝癌标本42例，带有癌旁肝硬化组织34例，男34例，女8例，年龄29~72岁（中位年龄49.4岁）；肿瘤直径≤50 mm者17例，＞50 mm者25例；门脉癌栓阳性者14例算作局部转移，阴性者28例算作局部无转移，所有患者术前均未经过化疗和放疗. Edmondson病理Ⅰ~Ⅱ级36例，Ⅲ~Ⅳ级6例；TNM临床Ⅰ~Ⅱ期12例，Ⅲ~Ⅳ期30例. 标本用40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片. 同期健康成年男性HE染色病理诊断正常肝脏组织标本10例（经家属同意）为对照组. 鼠抗人survivin mAb（4F7）购自美国Neomarker公司；免疫组化Elivision二步法检测试剂盒（即用型）购自福州迈新生物技术开发公司；鼠抗人PCNA mAb（pc10），鼠抗人p53 mAb（MAB0226，突变型）购自北京中山生物技术有限公司；原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国Roche公司.

　　1.2方法

　　1.2.1Survivin, PCNA和p53表达应用免疫组化（Elivision两步法）染色，切片常规脱蜡至水，置于pH 6.0的柠檬酸缓冲液行微波修复15 min，置冷，30 mL/L过氧化氢阻断内源性过氧化物酶20 min，羊血清封闭37℃ 20 min，滴加survivin（1∶100）, p53（1∶50）, PCNA（1∶50）一抗，置37℃恒温箱2 h，分别滴加两步法试剂盒中的A液和B液各50 μL分别室温孵育40 min, DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水透明后中性树胶封片，光镜下观察阳性细胞并按阳性标准计数. 以试剂公司提供的阳性对照片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照. survivin染色定位于胞质，呈棕黄色，切片根据阳性细胞百分率分为： 阳性（+），随机计数5个视野，每个视野阳性细胞率，取平均值，如大于10%则为阳性；阴性（-）没有或仅有弱的染色，阳性细胞率<10%. P53染色定位于胞核，呈棕黄色，阳性判断标准同survivin. PCNA染色以胞核染成棕黄色为阳性，增殖活性以PCNA标记指数（PCNALI）代表，随机计数500个细胞中阳性细胞数，PCNALI=（阳性细胞数/细胞总数）×100%.

　　1.2.2HCC凋亡检测经多聚赖氨酸处理的组织切片同免疫组化法脱蜡至水. 微波热修复处理15 min，将凋亡检测试剂盒中试剂1与试剂2按1∶9混合为TUNEL反应液. 取反应液50 μL滴加到组织上，置37℃恒温箱孵育1 h；滴加试剂3液50 μL 37℃孵育40 min；滴加BCIP/NBT显色15~30 min；核固红衬染5~10 min，自来水冲洗5 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片. 肝癌组织中TUNEL阳性信号（即凋亡细胞）呈现为蓝紫色颗粒，位于细胞核，核浓缩呈小圆形，散在分布，周围无炎性细胞浸润；未凋亡细胞核被衬染为粉红色. 凋亡活性以凋亡指数（apoptosis index, AI）表示，随机计数500个细胞中阳性细胞数，AI=（阳性细胞数/细胞总数）×100%.

　　统计学处理: 所得数据应用SPSS11.0统计软件包处理. Survivin的表达及其与p53及各临床病理指标之间的关系采用χ2检验，与AI，增殖指数（proliferation index, PI）的关系采用t检验. 生存分析采用Cox比例风险回归模型.

　　2结果

　　2.1Survivin表达与HCC临床病理特征的关系Survivin蛋白主要表达于肝癌细胞浆，免疫组化染色见胞浆内棕黄色颗粒，阳性细胞在肝癌组织内呈散在分布. 42例HCC中survivin阳性30例，阳性率为71.4%（图1A），癌旁肝硬化组织34例survivin阳性4例，阳性率为11.8%（图1B），正常肝组织为阴性（图1C）. HCC组织survivin的阳性率显著高于癌旁肝硬化组织和正常肝组织（P<0.001）. HCC组织survivin表达与肿瘤细胞分化程度有关，而与年龄、性别、分期、肿瘤大小、转移无关，Edmondson分级Ⅰ~Ⅱ级和Ⅲ~Ⅳ级患者survivin阳性率分别为40.0%和88.9%，两者差异显著（P=0.003，表1）. 应用Logistic回归分析得出病理分级是影响survivin表达的一个重要因素（P=0.002）. survivin 阳性者肝癌细胞增生凋亡比（PI/AI）显著高于survivin阴性者（4.03±0.92 vs 2.92±0.73, P=0.001）， 采用生存曲线的Logrank检验得出survivin阴性组生存期显著长于survivin阳性组（P=0.0148，图2）.表1Survivin表达与HCC各项病理指标之间的关系（略）

　　2.2PCNA, p53和凋亡在HCC组织中的表达PCNA表达于肝细胞核中，阳性细胞胞核呈棕黄色（图3A），肝癌组织中PI为30.8%，p53在的表达率为38.3%，阳性细胞胞浆呈棕黄色颗粒（图3B）. HCC组织中发生凋亡的细胞核被染成蓝色，复染的未凋亡细胞被染成粉红色（图3C）并结合HE染色排除坏死细胞，肝癌组织中AI为8.7%, P53表达阴性者survivin表达率（87.5%）显著高于P53阳性者（50.0%），两者差异有显著性（P=0.008）.

　　3讨论

　　肿瘤的发生与细胞死亡和增殖之间平衡失调关系密切. 有研究表明，随着肝细胞分化变差、瘤体直径变大、分期变晚，细胞凋亡率和增殖率均增加，然而凋亡率总是低于增殖率，并且在分化较差、体积较大、分期较晚、p53阳性的肝癌组织中增殖凋亡比越来越大（P<0.001）［4］. 结果发现30例肝癌组织和4例癌旁肝硬化组织中有survivin表达，而在10例正常肝组织无survivin表达. 这与以往在其他肿瘤组织中对survivin表达研究结果类似［5-6］. 统计学分析表明，survivin在肝癌组织中的阳性率显著高于肝硬化组织和正常肝组织，低分化肝癌组survivin的表达显著高于高分化组，且survivin阳性组增殖凋亡比显著高于survivin阴性组，survivin阳性组生存期显著短于阴性组，这些结果都说明survivin的高表达可能破坏细胞增殖与凋亡之间的平衡，在肝癌的发生发展中起重要作用［7］，survivin阳性表达可作为预测预后的重要指标. 同时本研究得出survivin在正常肝组织不表达而在肝癌组织中高表达使survivin的靶向成为可能. 我们还发现突变型p53（mtp53）蛋白阴性组survivin阳性率显著高于突变p53阳性组. 这说明mtp53阴性组肝癌至少部分通过survivin的表达获得抗凋亡能力，从而在肿瘤细胞的进一步恶性转化中发挥了作用. 而对于那些突变p53阳性的肝癌，survivin表达减弱，则通过凋亡删除一些老化的肿瘤细胞，选择更具有侵袭力、增殖旺盛的细胞克隆，促进肿瘤发生发展.

　　【】

　　［1］ Cohen C, Lohmann CM, Cotsonis G, et al. Survivin expression in ovarian carcinoma: Correlation with apoptotic marker and prognosis ［J］. Mod Pathol, 2003,16:574-583.

　　［2］ Kazuhiro K, Ryuichiro D, Masayuki K, et al. Survivin expression is a prognostic marker in pancreatic cancer patients ［J］. Surgery, 2004,136:443-448.

　　［3］ 李海民，孙凯，窦科峰，等. P53, P73, nm23H1基因在肝细胞肝癌中的表达与临床病理的关系［J］. 第四军医大学学报,2002,23(18):1718-1722.

　　［4］ 张惠中，高萍，林芳，等. 凋亡抑制因子反义寡核苷酸对肝癌细胞生物学作用［J］. 第四军医大学学报,2004,25(13):1232-1235.

　　［5］ Takizawa T, Kitagawa M, Hasegawa M, et al. Expression of IAP family proteins in esophageal cancer ［J］. Exp Mol Pathol, 2004,76(3):253-259.

　　［6］ Lo Muzio L, Staibano S, Pannone G, et al. Expression of the apoptosis inhibitor Survivin in aggressive squamous cell carcinoma ［J］. Exp Mol Pathol, 2003,70(3):249-254.

　　［7］ Lim IK. Spectrum of molecular changes during hepatocarcinogenesis induced by DEN and other chemicals in Fischer 344 male rats ［J］. Mech Aging Dev, 2003,124(5):697-708.