金钠多对体外缺氧致人大动脉内皮细胞分泌内皮素的影响

                           作者：李鸣皋，马贵喜，韩磊，刘玉，李靖，蒙果，刘昕

【关键词】  ；内皮缩血管肽类

    Effects of Ginaton on hypoxiainduced endothelin secretion from human aortic endothelial cells

　　【Abstract】　AIM: To explore the effects of Ginaton at different concentrations on the hypoxiainduced endothelin (ET) secretion from cultured vascular endothelial cells (VECs). METHODS:  Cultured VECs were divided into 5 groups: control group, simple hypoxia group, highconcentration Ginaton group, moderateconcentration  Ginaton group, and lowconcentration Ginaton group. For hypoxia, all groups except control group were put in a hypobaric chamber at the height of 5000 m for 30 min.  The ET contents in supernatant of VECs before hypoxia and 0.5 h after hypoxia, 6 h after hypoxia as well as 24 h after hypoxia were measured with radioimmunoassay. RESULTS:  ① Simple hypoxia promoted VECs secretion of ET and ET content increased significantly at 0.5 h after hypoxia and reached the peak at 6 h (P＜0.01). ② Ginaton inhibited VECs secretion of ET induced by hypoxia. At the time of 0.5 h after hypoxia, highconcentration Ginaton was more effective than  moderateconcentration and lowconcentration Ginaton (P＜0.01). At the time of 6 h and 24 h after hypoxia, moderateconcentration Ginaton was more significantly effective than highconcentration and lowconcentration Ginaton (P＜0.05). CONCLUSION:  Ginaton has significant protective effects on hypoxiainduced ET secretion from cultured VECs and the effects of moderateconcentration Ginaton are more obvious compared with those of highconcentration and lowconcentration Ginaton.

　　【Keywords】  endothelial, vascular/cytology; endothelins; ginaton; anoxia

　　【摘要】 目的： 探讨不同浓度金钠多对由缺氧所致培养的血管内皮细胞分泌内皮素功能的影响. 方法： 将培养的血管内皮细胞分为空白对照组、单纯缺氧组、缺氧加高浓度金钠多组、缺氧加中浓度金钠多组和缺氧加低浓度金钠多组. 采用低压舱上升至5000 m高度、停留30 min，对培养的血管内皮细胞进行缺氧. 用放射免疫法测定缺氧前和缺氧后0.5, 6, 24 h各组细胞培养液中内皮素含量. 结果： ① 急性缺氧可显著促进血管内皮细胞分泌内皮素，缺氧后0.5 h内皮素含量即显著升高，于缺氧后6h分泌内皮素含量最高. ② 金钠多能明显抑制缺氧促血管内皮细胞分泌内皮素的作用，在缺氧后0.5 h表现出高浓度金钠多强于中浓度和低浓度金钠多组，在缺氧后6和24 h则中浓度金钠多的作用要强于高浓度和低浓度组. 结论： 金钠多能显著抑制缺氧促血管内皮细胞分泌内皮素的作用，且中浓度金钠多较高浓度和低浓度金钠多作用更明显.

　　【关键词】　内皮，血管/细胞学；内皮缩血管肽类；金钠多；缺氧

　　0引言

　　缺氧是多种疾病和损伤发生过程中的中心环节之一. 缺氧对血管内皮细胞（vascular  endothelial  cells, VEC）的结构和功能有着复杂和明显的影响，缺氧可刺激血管内皮细胞生成和释放内皮素（endothelin, ET）增加，血浆ET含量明显增高. 有关药物如内皮素受体拮抗剂、内皮素转化酶抑制剂及中药对血管内皮细胞分泌ET的影响有不少报道［1］，但是金钠多对缺氧所致血管内皮细胞分泌ET的影响尚未见报道. 我们采用培养的人大动脉血管内皮细胞，通过低压舱模拟缺氧，分别观察缺氧对血管内皮细胞分泌ET的影响及不同浓度金钠多的保护作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　低压舱（由本院高压氧中心提供），内皮细胞采用由CBI公司提供的人大动脉血管内皮细胞体系，培养液及内皮细胞生长因子由CBI 公司配套提供，金钠多(德国威玛舒培博士药厂)、内皮素放免试剂盒（由华英所提供）. 细胞取回后按照常规方法进行细胞复苏，调整细胞合适浓度，接种于75 cm2细胞培养瓶中，放置于细胞培养箱中进行培养，待细胞长满瓶底后，用胰酶消化、传代. 当细胞传至第3代时，将细胞接种于24孔细胞培养板中（接种密度为5000 cell/cm2）,继续培养，待细胞生长满融合后，准备进行干预实验.

　　1.2方法

　　将培养的内皮细胞按每组8例样本分为5组： 对照组、单纯缺氧组、缺氧加高、中、低浓度金钠多组. ① 对照组： 为细胞培养液不加特殊试剂，也不受缺氧因素影响，但于缺氧组缺氧前后相对应的时间点取上清液100 μL，待测定ET浓度；② 单纯缺氧组： 将单纯缺氧组置于低压舱内，上升至5000 m高度，停留30 min，以造成细胞缺氧，缺氧后将细胞放回培养箱中继续培养，分别于缺氧前和缺氧后0.5, 6, 24 h取上清液100 μL. ③ 缺氧加不同浓度金钠多组： 在缺氧加不同浓度金钠多各组的细胞培养液中分别加入金钠多使之终浓度分别为25, 10, 5 mg/L，然后同单纯缺氧组一起置于低压舱内上升至5000 m高度，停留30 min造成缺氧. 分别于缺氧干预前和缺氧干预后0.5, 6, 24 h取上清液100 μL. 上述各组标本抽取后，均置于用抑肽酶处理过的离心管中，-20℃低温保存.  由专人用同一批试剂采用放免方法测定培养液ET浓度.

　　统计学处理：  结果以x±s表示，采用SAS 8.2统计学软件进行数据处理，所用方法为有一个重复测量的两因素设计的方差分析，组间两两比较用Bonferroni方法分析，P＜0.05为差别有统计学意义.

　　2结果

　　2.1单纯缺氧对VEC分泌ET的影响单纯缺氧组与空白对照组比较，于缺氧前无差异，于缺氧后0.5, 6, 24 h三个时间点ET含量均增高（P<0.01, Tab 1）.  在单纯缺氧后0.5, 6, 24 h三个时间点之间ET含量的比较中，缺氧后6 h的ET含量最高，缺氧后24 h次之，缺氧后0.5 h最低（P<0.01）. 以上结果提示，在缺氧后0.5 h内皮素含量即已开始增高，至6 h时达较高水平，到24 h时ET含量有所降低，但仍高于缺氧前的含量.表1缺氧对血管内皮细胞分泌ET的影响（略）

　　2.2金钠多对缺氧所致VEC分泌ET的影响将单纯缺氧组作为对照组，缺氧加不同浓度的金钠多各组分别同其比较发现，高浓度金钠多组在缺氧后0.5 h及24 h两个时间点，内皮素含量要显著低于单纯缺氧组（P<0.01），在缺氧后6h内皮素含量与单纯缺氧组相比较无差别；低浓度金钠多组在缺氧后0.5 h，内皮素含量较单纯缺氧组高，在缺氧后6 h内皮素含量低于单纯缺氧组（P<0.05），缺氧后24 h则显著低于单纯缺氧组（P<0.01）；中浓度金钠多组在缺氧后0.5, 6, 24 h时间点的内皮素含量均显著低于单纯缺氧组（P<0.01），中浓度金钠多组在缺氧后6, 24 h时间点的内皮素含量分别同高浓度和低浓度金钠多组相对应时间点比较要低（P<0.05,表2）.表2金钠多对缺氧所致VEC分泌ET的影响 （略）

　　3讨论

　　血管内皮细胞合成分泌多种血管活性物质，如： ET, 血管紧张素Ⅱ（ATⅡ）, 前列环素(PGI2)等，在调节血管收缩舒张功能、止血与抗血栓形成功能平衡及血管壁的组织修复和免疫功能等方面发挥重要作用［1］. 在缺血或缺氧条件下，VEC的结构和功能均产生复杂变化，对缺血和缺氧病理生理过程产生重要影响. 本实验发现，单纯缺氧后05 h, ET含量较缺氧前增加，缺氧后6达高峰，缺氧后24 h有所下降，但仍高于缺氧前（P＜0.01），与报道的基本一致［2］. 缺氧因素引起VEC分泌ET增加的主要机制是缺氧激活VEC细胞膜钙通道，引起钙离子内流，使细胞内钙离子浓度升高，信息最终被传递到达ETmRNA使mRNA表达增多，ET水平升高［2］.
 
　　金钠多（Ginaton, EGB761）是目前世界上公认的标准化银杏叶提取物，在临床多种疾病的预防和上的应用价值得到广泛肯定. 本实验结果提示，三种不同浓度金钠多均具有明显降低缺氧条件下VEC分泌ET的作用，且发现中浓度金钠多（10 mg/L）较高浓度（25 mg/L）和低浓度金钠多（5 mg/L）更明显的保护作用. 金钠多降低缺氧条件下VEC分泌ET的作用，可能与金钠多的抗氧化活性和抗自由基活性相关［3］，与金钠多抑制细胞内肌浆网Ca2+释放进而降低细胞内Ca2+浓度，最终阻断ETmRNA过多表达有关［4］，与金钠多特异性地抑制血小板活化因子及调节兴奋性与抑制性氨基酸的平衡作用相关［5］. 金钠多降低缺氧条件下VEC分泌ET的作用，可能是其临床上治疗心脑血管疾病过程中发挥重要作用的机制之一.

　　【文献】

　　［1］  郭峰，吉民，华维一，等. 内皮素及其受体拮抗剂的研究进展［J］. 药物与临床,2003,3（4）:281-290.

　　［2］ 高文祥，高钰琪，李素芝，等.　缺氧对世居高原藏族人脐静脉内皮细胞ET和NO水平的影响［J］. 中国应用生杂志，2005,21（1）:1-4.

　　［3］ 王玉英，胡涛，贾国良，等.　银杏叶提取物对人脐静脉内皮细胞增殖的影响［J］.　第四军医大学学报，2004,25（13）:1179-1181.

　　［4］  Li Z, NaKaya Y, Niwa Y, et al. K(Ca) channel opening activity of Ginkgo biloba extracts and ginsenosides in cultured endothelial cells ［J］. Clin Exp Pharmacol Physiol,  2001,28(56):441-445.
 
　　［5］  胡波，梅元武，孙圣刚，等. 银杏叶提取物对大鼠缺血在灌注皮质内氨酸动态平衡的影响［J］. 脑与神经杂志，2001,9（1）:1-3.