实验性脊髓空洞前状态神经元凋亡及NF

                                                               作者：孙国柱，张庆俊，张更申，李建峰

【关键词】  性脊髓

    Effect of NFκB, Bcl2 and Bax on neuronal apoptosis in experimental presyrinx state

       【Abstract】 AIM: To investigate neuronal apoptosis in experimental presyrinx state and the regulatory role and mechanism of NFκB, Bcl2 and Bax in rabbits. METHODS:  The experimental syringomyelia models of rabbits were established by intracisternal injection of Kaolin. Neuronal apoptosis and the expressions of NFκB, IκB, Bcl2 and Bax were measured with TUNEL and immunohistochemistry in 1, 3, 7, 14 and 21 d after operation respectively. RESULTS:  Compared with that in control group, the NFκB expression in Kaolin group increased from the 1st day after operation, reached its peak at 3rd day, remained there till 7th day, and returned to a normal level at 14th day approximately. The IκB expression showed a negative correlation with NFκB at the same time points. The Bcl2 and Bax expressions increased from the 1st day, reached its peak at 7th day, remained there till 14th day, and then began to drop. CONCLUSION:  In presyrinx state of experimental syringomyelia, the increasing expression of NFκB mainly upregulates its target gene Bax, thus inducing neuronal apoptosis to involve in nervous function injury.

    【Keywords】 NFκB; syringomyelia; TUNEL; immunohistochemistry; apoptosis

    【摘要】 目的： 研究实验性脊髓空洞前状态神经元凋亡及NFκB，Bcl2，Bax的调控作用. 方法： 选用新西兰白兔，用TUNEL法和免疫组化技术检测脊髓空洞前状态脊髓神经元凋亡情况和NFκB，IκB，Bcl2，Bax表达变化. 结果： 高岭土组动物在术后各个时段均有神经元凋亡发生，以7～14 d最为多见；NFκB于术后1 d就有表达增高，在3 d达到高峰，维持至7 d后开始回落，14 d时基本恢复正常水平；IκB的表达与NFκB的表达呈负相关依存关系；Bcl2和Bax表达则于术后1 d开始增加，到术后7 d达高峰，持续至14 d后开始下降. 结论： 脊髓空洞前状态过程中，作为多向转录调节作用的核蛋白因子NFκB表达增高，主要上调其靶基因Bax，诱导神经元凋亡，参与实验性脊髓空洞前状态神经功能损害.

    【关键词】 NFκB； 脊髓空洞症； TUNEL法； 免疫组化； 细胞凋亡

    0引言

    脊髓空洞症（Syringomyelia，SM）是一种发病隐匿、缓慢进展的脊髓退行性病变，发病机制尚不完全清楚. 由于缺乏有效方法，故预后不佳. 我们先前的研究［1］证实，SM在形成前2 wk内存在着缺血水肿，称之为脊髓空洞形成前期，国外称其为空洞前状态（Presyrinx state）［2］. 近年来，有证据表明在神经系统发育和急慢性损伤中可见到凋亡发生［3-4］，但脊髓空洞前状态中是否存在细胞凋亡少见报道. 为此，我们检测脊髓空洞前状态中神经元凋亡情况和NFκB，IκB，Bcl2，Bax表达变化，探讨NFκB，Bcl2和Bax对神经元凋亡的调控作用，为阐明其发病机制和探索有效的治疗手段开辟一条新的途径.

    1材料和方法

    1.1材料健康新西兰大白兔56只(河北医科大学实验动物中心)、体质量1.5～2.0 kg，雌雄不拘. 一抗为鼠抗NFκBp56多克隆抗体（Parmingen公司)；鼠抗IκBα mAb、鼠抗Bcl2 mAb、鼠抗Bax mAb (Santa Cruz公司). SABC免疫组化试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德公司产品). 高岭土(分析纯，上海试剂四厂) . HPIAS1000彩色病理图文分析系统（同济医科大千屏影像公司）.

    1.2方法

    1.2.1动物分组和模型制作将动物随机分为3组，高岭土组40只，生理盐水组和假手术组各8只. 动物在氯胺酮（30 mg/kg）耳缘静脉麻醉下，经皮枕大池穿刺，缓慢抽出无色透明脑脊液0.6 mL后，高岭土组动物注入37℃，250 g/L高岭土悬浊液0.6 mL；生理盐水组动物注入37℃生理盐水0.6 mL；假手术组动物仅行枕大池假穿刺.

    1.2.2术后神经功能判定按改良的Tarlov评分法对动物进行行为学检查评分. 0分:肢体完全瘫痪；1分：有肢体运动，但不能站立；2分：可站立，但不能行走、负重；3分：可行走、负重，但步态不稳；4分：正常.

    1.2.3标本的制作和采集生理盐水组和假手术组在术后、高岭土组在第1，3，7，14，21日各随机选取动物8只，在氯胺酮过度麻醉下，40 g/L多聚甲醛经心脏灌注, 经后正中切口，咬除脊突和椎弓根，取出上颈髓置入相同固定液中后固定24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋、4 μm切片并裱于经10 g/L多聚赖氨酸处理的清洁载玻片，用于HE染色和免疫组织化学染色观察.

    1.2.4免疫组化染色NFκB，IκB，Bcl2和Bax的表达按免疫组织化学常规步骤进行. 细胞内有棕黄色粗颗粒分布或棕黄色细腻颗粒分布者为阳性反应细胞. 采用病理图文分析系统，每张切片任取5个视野，高倍镜下记数总细胞数和阳性细胞数.

    1.2.5TUNEL法检测细胞凋亡按试剂盒说明书操作. 阳性判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞.统计学处理：各组实验数据以x±s表示，采用SPSS 11.0专用统计程序进行方差分析. 检验结果以P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1术后动物神经功能高岭土组动物于术后第7日出现神经功能障碍，包括厌食、精神萎靡、四肢无力，甚至瘫痪,并随时间的延长逐渐加重，与生理盐水组和假手术组对比有显著差异(P<0.05，表1).

    表1各组动物的Tarlov评分及脊髓空洞前状态中上颈髓组织中(略)

    2.2光镜观察高岭土组动物于术后第3日出现神经元、血管周围间隙增宽，表现为轻度水肿；第7，14日水肿程度加重（图1），核膜、核仁稍显模糊，神经元胞体内尼氏体减少，胶质细胞增生，中央管饱满，室管膜细胞受压变平，管周组织疏松，呈明显水肿改变，蛛网膜下腔可见高岭土沉积，大量炎性细胞浸润. 第21日水肿稍显减轻，但持续存在，胞质空泡出现，前角细胞数量减少，胶质细胞增生明显，中央管张力增加，室管膜上皮断裂、脱落， 高岭土肉芽肿形成. 生理盐水组和假手术组动物脊髓神经元轮廓正常，核及核仁清楚，胞质内尼氏体分布均匀，神经胶质细胞亦正常.图1高岭土注入后14 d上颈髓前角水肿的神经元HE ×160

    2.3脊髓空洞前状态中不同时段NFκB，IκB的表达高岭土组动物上颈髓组织中NFκB在神经元和神经胶质细胞质及胞核中均有表达，于术后第1日明显升高，第3～7 d日达高峰（图2），到2 wk时基本恢复正常. IκB主要在神经元和神经胶质细胞质中表达，与NFκB表达呈负相关，于术后第1日明显降低，维持低水平至第7日，到2 wk时基本恢复正常. 生理盐水组和假手术组动物上颈髓组织中仅有弱表达. 彩色病理图文分析系统测定的切片中阳性反应物中的面积百分比结果见表1.图2高岭土注入后7 d  NFκB在上颈髓前角神经元中的表达SABC ×40

    2.4脊髓空洞前状态中细胞凋亡情况和Bcl2，Bax表达高岭土组动物术后不同时段中脊髓灰质神经元均有凋亡发生，以7～14 d最为多见（图3）. 典型的凋亡细胞表现为染色质凝集、边集化，呈新月形聚集于核膜下. 因切面的不同，凝集的染色质以不同形态散在于核切面的任意位置，或以圆形位于核膜下，或位于核中央. 神经元凋亡于术后第1日增加，7～14 d达高峰，以后逐渐降低，21 d仍可见到凋亡发生. Bcl2， Bax阳性表达与神经元凋亡基本一致（图4，5）. 正常对照组和假手术组动物上颈髓内可见到少量凋亡的少突胶质细胞，Bcl2，Bax仅有少量弱阳性反应细胞. 阳性细胞的百分比结果见表2.图3高岭土注入后7 d上颈髓前角TUNEL阳性神经元TUNEL ×40图4高岭土注入后14 d Bcl2在上颈髓前角神经元中的表达SABC  ×40

    3讨论

    本研究表明，脊髓空洞前状态过程中存在两种细胞死亡形式，一种为死亡，另一种为凋亡，两者共同引起脊髓神经功能损害. 其中，后者于术后1 d出现增加，7 d达高峰，以后逐渐降低，21 d时仍可见到凋亡发生，表明细胞凋亡参与了脊髓空洞前状态的发展过程. 也有类似报道脊髓缺血诱导凋亡发生. Kato等［5］用导管阻塞降主动脉使脊髓急性缺血，观察到凋亡于1～2 d出现，主要位于灰质后根背侧的小神经元.  Sakurai等［6］在兔脊髓缺血模型中发现运动神经元存在凋亡现象，高峰时间在7 d，脊髓缺血后产生大量自由基、兴奋性氨基酸、NO积聚，并导致细胞内钙离子超载，最终引起某些原癌基因的表达，诱导细胞凋亡的发生.图5高岭土注入后14 d Bax在上颈髓前角神经元中的表达SABC ×40

    表2脊髓空洞前状态上颈髓组织中凋亡细胞（略）

    有研究证实NFκB也具有促进中枢神经系统神经凋亡的作用. 在静息情况下其位于胞质内，与IκB结合成复合物处于失活状态. 细胞受到刺激后，IκBα磷酸化后被降解，从NFκB/IκBα复合物上解离下来，NFκB恢复活性，通过核膜上的受体进入细胞核，与靶基因κB位点结合，迅速诱导靶基因的转录而发挥作用. Scheneider等［7］发现小鼠后脑缺血半球的NFκB激活使p65基因敲除小鼠的缺血性脑损伤明显减轻，从而首次利用基因技术证明NFκB在局灶性脑缺血中具有促神经元凋亡的作用. Ueno等［8］利用靶向NFκB的圈套脱氧寡核苷酸(decoy ODN)方法证实了NFκB的活化可加重大鼠全脑缺血模型的神经元凋亡，进一步证明了NFκB具有促进神经细胞凋亡的作用. Shou等［9］观察到鼠脑局部缺血时海马中NFκB激活能上调促凋亡基因Bax蛋白表达. Tamatani等［10］也证实，在鼠海马中NFκB激活能上调Bax，Bcl2 的表达且这些种作用能被IκBa抑制. 但NFκB与脊髓空洞前状态神经细胞凋亡的关系尚未见相关报道.本实验结果显示，在脊髓空洞前状态形成过程中，NFκB和IκB与Bcl2和Bax无论在空间上还是在时间上均存在特定的依赖性. IκB的表达与NFκB的表达呈负相关依存关系. 而Bcl2和Bax表达则于术后1 d开始增加，到术后7 d达高峰，持续至14 d后开始下降，其中Bax表达明显高于Bcl2. 提示脊髓空洞前状态神经元凋亡的发生机制可能是由于：高岭土注入枕大池后，广泛地分布于上颈髓蛛网膜下腔，随着病程的进展，逐渐形成无菌性蛛网膜炎，加之其对脊髓前后动脉、静脉产生直接压迫，导致上颈髓髓缺血、水肿，诱导NFκB表达增加，上调靶基因Bax和Bcl2，但Bax表达明显高于Bcl2，继而引起细胞凋亡.

    【】

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