可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株的构建

                                                      作者：徐颖,田玉科,田学愎,梅伟,安珂,杨辉

【关键词】  可诱

    comConstruction of an immortalized rat astrocyte strain with inducible enkephalin expression

    【Abstract】 AIM: To construct an immortalized rat astrocyte strain (IAST) expressing enkephalin regulated by Doxycycline. METHODS:  Human preproenkephalin gene (hPPE) was inserted into the plasmid pRevTRE to construct recombinant retroviral vector pRevTRE/hPPE. pRevTetOn and pRevTRE/hPPE were separately transfected into packaging cell PT67. The RevTetOn virus supernatants were used to infect IAST and positive colonies were transiently transfected with pRevTRELuc plasmid. One IAST/TetOn clone with high inducibility and low background was selected by detecting luciferase activity. RevTRE/hPPE virus was used to infect the IAST/TetOn strain. IAST that stably expressed Tetregulated enkephalin was established. hPPE gene expression levels of IAST/TetOn/hPPE cell strains were detected by RTPCR, immunocytochemistry and indirect immunofluorescence staining. RESULTS:  A recombinant retroviral vector pRevTRE/hPPE was constructed successfully. The inducibility multiple of the IAST/TetOn cell strain was 20.6. RTPCR and immunocytochemistry confirmed that enkephalin expression level was regulated by Doxycycline in a dosedependent manner. CONCLUSION:  An IAST which secretes enkephalin under the control of Doxycycline has been established successfully, which provides a good basis for further research on regulated gene therapy for chronic pain.

    【Keywords】 human preproenkephalin; gene expression regulation; polyomavirus transforming; astrocyte

    【摘要】 目的：构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株（IAST）. 方法：应用分子克隆技术构建含人前脑啡肽原基因（hPPE)的逆转录病毒四环素反应质粒（pRevTRE/hPPE）；以脂质体转染法将重组质粒pRevTRE/hPPE和调节质粒pRevTetOn分别转染入包装细胞PT67,分别收集病毒上清；将含有RevTetOn病毒上清感染IAST,挑选单克隆并瞬时转染报告质粒pRevTRELuc,通过检测萤光素酶活性,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低IAST/TetOn细胞株；再将RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/TetOn细胞株,得到稳定表达脑啡肽的IAST/TetOn/hPPE细胞株,通过RTPCR、免疫细胞化学及间接免疫荧光染色检测该细胞株中强力霉素定量调控脑啡肽的表达. 结果：重组逆转录病毒载体pRevTRE/hPPE构建成功；经挑选得到了高表达、低背景IAST/TetOn细胞株,其诱导倍数为20.6；在IAST/TetOn/hPPE细胞株中,hPPE基因表达受强力霉素调控,呈剂量依赖关系. 结论：成功构建了受四环素及其衍生物强力霉素定量调控表达脑啡肽的永生化IAST,为可调控基因慢性疼痛的研究奠定了基础.

    【关键词】 人前脑啡肽；基因表达调控；多瘤病毒转化；星形胶质细胞

    0引言

    转基因细胞移植镇痛为慢性疼痛的治疗开辟了新领域［1］,但传统的转基因镇痛模式不能调控镇痛物质的分泌,外源镇痛基因在宿主体内持续表达可带来诸多不良后果. TetOn基因调控系统通过四环素及其衍生物强力霉素来调节目的基因的定量表达,是在分子水平精确调控外源基因表达的较好工具［2-3］. 为安全有效实施转基因镇痛,我们拟运用逆转录病毒四环素调控系统,建立可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株（immortalized rat astrocyte strain, IAST）,并在体外观察强力霉素对脑啡肽表达的定量调节.

    1材料和方法

    1.1材料原代培养的永生化IAST系本实验室构建［4］. 逆转录病毒载体RevTetOn系统（包括调节质粒pRevTeton、反应质粒pRevTRE、报告基因pRevTRELuc、包装细胞PT67，Tet系统专用血清）购自Clontech公司；表达载体pCMVhPPE(含目的基因hPPE )由美国学者Wilson博士惠赠；DH5α感受态细菌由本室制备. Polybrene，G418，强力霉素购自美国Sigma公司. 各种限制性内切酶、T4DNA连接酶为日本TaKaRa公司产品. Lipofectamin2000TM为Invitrogen公司产品. MMLV Reverse Transcriptase逆转录酶及萤光素酶分析试剂盒购自Promega公司. 亮氨酸脑啡肽多克隆抗体购自美国Chemicon公司. 萤光发光计TD20/20为Turner Biosystem公司产品.

    1.2方法

    1.2.1可调控逆转录病毒表达载体的构建根据GenBank中hPPE基因序列(No：AH005276)及pRevTRE多克隆位点设计一对引物,引物两端分别带有BamHⅠ,HindⅢ酶切位点. 上游引物：5′CGGATCCTCCTCAGTGGACGTT3′（含有BamHⅠ酶切位点）；下游引物CCAAGCTTAACACCATCAACAGTT3′（含有HindⅢ酶切位点）. 以表达载体pCMV/hPPE为模板PCR扩增hPPE基因片段. 琼脂糖电泳PCR扩增产物,凝胶回收950 bp的hPPE基因片段, 用BamHⅠ，HindⅢ双酶切后,与BamHⅠ，HindⅢ线性化的载体pRevTRE连接,获得重组逆转录病毒载体pRevTRE/hPPE,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取质粒DNA, 经PCR、酶切分析及DNA序列测定鉴定.

    1.2.2逆转录病毒载体的包装脂质体（lipofectamine）介导分别将质粒pRevTRE/hPPE，pRevTetOn转染逆转录病毒包装细胞PT67. 质粒pRevTeton含有新霉素抗性基因（Neo）,经G418（500 mg/L）筛选后,获得稳定产生RevTeton病毒的包装细胞系PT67RevTeton；质粒pRevTRE/hPPE含有潮霉素抗性基因（Hyg）,经潮霉素(500 mg/L)筛选后,获得稳定产生RevTRE/hPPE病毒的包装细胞系PT67RevTRE/hPPE.

    1.2.3萤光素酶活性检测将含有RevTeton病毒上清感染IAST细胞株,经G418 (500 mg/L)筛选后得到抗性克隆,采用有限稀释法挑选单克隆,共形成48个单细胞克隆,命名为IAST/TetOn,分别编号为No.1～No.48. 报告质粒pRevTRELuc和pCMVβgal共转染到48个IAST/TetOn细胞克隆,加入强力霉素诱导萤光素酶表达. 检测萤光素酶的活性（按萤光素酶分析试剂盒说明书进行）,β半乳糖苷酶作为转染效率的内标. 具体操作见［5］. 标准萤光素酶活性值＝萤光素酶活性值（RLU，relative luciferase unit）/β半乳糖苷酶活性值（A420 nm）. 根据测得的标准萤光素酶活性值强力霉素诱导倍数：诱导倍数=（＋强力霉素孔标准萤光素酶活性值）/（－强力霉素孔标准萤光素酶活性值）. 挑选诱导表达高、背景表达低的细胞克隆,扩大培养后进行下一步试验.

    1.2.4强力霉素诱导hPPE表达的检测将含有RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/TetOn细胞克隆,经潮霉素400 mg/L，G418 400 mg/L共同筛选后获得稳定表达hPPE基因IAST/TetOn细胞株,命名为IAST/TetOn/hPPE. 在六孔板中加入含IAST/TetOn/hPPE细胞数1×108/L的细胞悬液1 mL, 培养24 h后,细胞培养液中分别加入不同浓度的强力霉素（0, 0.1, 1, 10 mg/L）诱导培养,并以未转染基因hPPE的IAST细胞作为阴性对照细胞. 72 h后,用Trizol试剂提取各组细胞总RNA,采用半定量RTPCR分析强力霉素诱导hPPE表达水平. 按照RTPCR试剂盒说明书,逆转录酶反转录cDNA第一链,取等量的cDNA为模板加入目的基因hPPE或内参照β肌动蛋白上、下游引物进行30轮PCR扩增,PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,采用凝胶图像分析仪测定目的基因hPPE和β肌动蛋白的积分光密度值（integrated optical density, IOD）, 实验重复3次. hPPE基因表达强度以hPPE基因和β肌动蛋白IOD比值的均数表示.

    1.2.5间接免疫荧光染色检测强力霉素诱导hPPE表达水平将细胞IASTTetOn/hPPE制成细胞爬片,一组培养液中加入强力霉素1 mg/L,另一组培养液不加强力霉素做为阴性对照. 培养72 h后甲醇固定,加入亮氨酸脑啡肽多克隆抗体（1∶1000）,4℃过夜；再加FITC标记荧光二抗（1∶100）室温孵育1 h；PBS漂洗3次,PI复染细胞核1 min,加甘油缓冲液封片,尼康TE2000S荧光显微镜下观察. 免疫荧光强度的判定方法如下：～：荧光闪亮,呈明显的亮绿色；：荧光明亮,呈黄绿色, ＋：荧光较弱,但清楚可见；±：极弱的可疑荧光；－：无荧光.统计学处理： 采用SPSS 10.0软件对RTPCR半定量结果进行Spearman相关分析,P＜0.05差异有统计学意义.

    2结果

    2.1重组质粒的酶切鉴定及DNA序列测定用BamHⅠ，HindⅢ双酶切pRevTRE/hPPE,出现两条特异性条带,大片段与空载体pRevTRE相同（约6400 bp）,小片段与hPPE PCR产物相同,约950 bp,与酶切图谱相符,证实重组质粒中含有hPPE基因（图1）.M: marker; 1:PCR鉴定重组体pRevTRE/hPPE; 2:BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组体 pRevTRE/hPPE; 3:BamHⅠ单酶切重组体p RevTRE/hPPE; 4: BamHⅠ单酶切pRevTRE.图1重组质粒pRevTRE/hPPE的酶切鉴定及PCR鉴定

    2.2高诱导表达低背景表达萤光素酶IAST/TetOn细胞株的挑选经过有限稀释法挑选,共形成48个阳性克隆细胞. 瞬时转染pRevTREluc,强力霉素诱导前后萤光素酶活性见图2. 挑选6号克隆的细胞作为高诱导低背景表达细胞株. 从图2看出其诱导表达值为876.1 RLU/A420 nm, 背景表达值为42.5 RLU/A420 nm,诱导倍数为20.6,所以6号即为我们需要的高表达低背景的细胞株.

    图2不同IASTTetOn克隆诱导前后的萤光素酶活性

    2.3IAST/TetOn/hPPE细胞hPPE基因的诱导表达如图3所示, β肌动蛋白扩增片段为482 bp, hPPE扩增片段为950 bp；IAST/TetOn/hPPE细胞中没有加入强力霉素时,有很少量的hPPE基因表达；当培养液中加入强力霉素后,hPPE基因表达开放. 强力霉素剂量与hPPE mRNA表达量呈显著正相关（rs＝0.972,P<0.05）,hPPE mRNA表达量以强力霉素浓度依赖方式逐渐增加.

    图3RTPCR检测不同浓度的强力霉素诱导IAST/TetOn/hPPE细胞中hPPE mRNA的表达

    2.4强力霉素诱导亮脑啡肽表达的免疫荧光染色图4A所示,hPPE/IAST/TetOn细胞中没有加入强力霉素时, 细胞质内可见较弱绿色荧光,荧光强度为（＋）；而图4B显示加入强力霉素诱导72 h后,荧光闪亮,呈明显的亮绿色,荧光强度为（）,提示加入诱导剂强力霉素后亮脑啡肽表达明显增加.A： 未加强力霉素； B： 强力霉素1 mg/L诱导72 h.图4强力霉素诱导亮脑啡肽表达免疫荧光染色间接免疫荧光染色 ×400

    3讨论

    转基因细胞移植镇痛是将外源性镇痛物质基因导入靶细胞内,再将这种基因修饰细胞回输入机体内,使其分泌具有镇痛作用的活性产物. 前脑啡肽原基因是慢性疼痛基因中一种较为理想的选择［6］. 它编码的前脑啡肽原经酶切加工出蛋氨酸脑啡肽和亮氨酸脑啡肽. 脑啡肽是一种内源性阿片肽,广泛分布于外周和中枢神经系统,是中枢神经系统重要的镇痛介质.为安全有效实施转基因镇痛,必须使体内镇痛基因的表达受到精确调控,按需产生一定数量和浓度的阿片肽以满足机体的需要. 我们采用的RevTetOn逆转录病毒载体系统，是一种新型的可诱导性真核细胞基因表达载体，可用四环素及其衍生物强力霉素来调节外源基因的表达. 实验过程中,首先将人前脑啡肽原基因（hPPE）克隆到pRevTRE载体上,将鉴定好的重组质粒和调节质粒pRevTetOn分别转染入包装细胞系,通过抗生素抗性筛选得到能产生高滴度病毒的包装细胞,然后用包装细胞产生的病毒来感染IAST细胞, 使用RevTetOn基因表达系统时,还需要检测靶细胞对四环素诱导的反应性,这是由于pRevTetOn整合位点的差别致不同阳性克隆表达四环素调控反式激活子 （reverse tetcontrolled transactivator,rtTA）蛋白量存在很大差异,只有高表达rtTA的克隆,才可能对四环素有较高的诱导倍数［7］. pTRELuc是带有萤光素酶报告基因的反应质粒,含有四环素反应元件（tetracycline responsive element,TRE）,可用来筛选和验证建立的TetOn细胞株. 我们筛选出48株IAST/TetOn细胞克隆,并瞬时转染pTRELuc来挑选高诱导、低背景TetOn细胞株. 挑选的6号细胞克隆萤光素酶本底表达最低,加入诱导剂强力霉素后表达量最高,诱导倍数为20.6. 随后将hPPE基因转染到该IAST/TetOn细胞后,通过RTPCR、免疫细胞化学和免疫荧光染色观察到hPPE基因表达受强力霉素诱导调控,且hPPE表达量与强力霉素浓度呈剂量依赖关系,随着强力霉素浓度增高,hPPE的表达量随之增高. 从实验结果我们还可以看出,当不存在强力霉素诱导时,仍有少量的hPPE基因表达,这与rtTA的残余活性所导致目的基因的背景表达有关. 目前,通过对TetOn系统改建形成的四环素调控的tTS转录沉默子（tetracycline controlled transcriptional silencer, tTS）/TetOn系统,它能有效抑制rtTA的基础活性,从而实现对目的基因表达调控更加精密［8］.我们利用逆转录病毒四环素调控系统,建立了受四环素调控表达人前脑啡肽原基因的大鼠星形细胞系,将来把该细胞株移植到体内,即可以根据疼痛状态,人为地调控镇痛基因表达的时间和水平. 该细胞系的建立为可调控转基因细胞移植治疗慢性疼痛提供了理想的细胞载体.

    【】

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