靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL

                               作者：伊正君，朱道银，杨春，李俊明，何永林，陈全

【关键词】  靶向

    comConstruction and identification of a Mycobacterium smegmatis strain to targetedly deliver eukaryotic coexpression plasmid encoding human granulysin and murine single chain IL12

       【Abstract】 AIM: To construct a recombinant Mycobacterium smegmatis strain that can targetedly deliver the eukaryotic coexpression plasmid pZM03 encoding human granulysin (GLS) and murine single chain IL12 into macrophages. METHODS:  Coding sequences of human granulysin, murine single chain IL12 and OriM were simultaneously cloned into pBudCE4.1, which had multiple promoters to form the shuttle plasmid pBudCE4.1/GLS/IL12/OriM (simply named pZM03). The shuttle plasmid was transformed into mc2155 and identified from the recombinants by PCR. The targeting property of the recombinant was detected by coincubating the strains with murine macrophage RAW264.7. RESULTS:  The new recombinant strain that could targetedly deliver pZM03 into macrophages was successfully constructed. CONCLUSION:  It is feasible to targetedly deliver eukaryotic expression plasmids into macrophages by using Mycobacterium smegmatis as an attenuated biological vector.

    【Keywords】 granulysin; interleukin 12; Mycobacterium smegmatis; shuttle plasmid; macrophage

    【摘要】 目的:构建携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠单链IL12基因的真核共表达载体pZM03，并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗. 方法:将人GLS，小鼠单链IL12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中，得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2155，通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒；通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性. 结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌. 结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.

    【关键词】 颗粒溶素；白细胞介素12；耻垢分枝杆菌；穿梭质粒；巨噬细胞

    0引言

    结核病位居单一病原引起死亡的严重传染病之首［1］. 在结核病的感染、发病与过程中，宿主本身的免疫素质和免疫状态是决定预后转归的重要因素［2］. 其中巨噬细胞既是重要的抗原呈递细胞，也是参与形成潜伏感染的关键环节. 本研究目的旨在构建一种携带人天然颗粒溶素（granulysin，GLS）和小鼠单链IL12基因的真核共表达载体pZM03、并可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗. 为明确该重组疫苗的靶向递送和目标基因在巨噬细胞内的转录和表达效果，我们首先在细胞水平上进行了初步探索.

    1材料和方法

    1.1材料携带人GLS基因的质粒pGLS738由本实验室构建；携带小鼠单链IL12基因的质粒pSFGmIL12由Graham J.Liechke博士惠赠，其中p40，p35两亚单位基因由一45 bp的Linker连接，其编码产物的生物学活性已在活体内证明；含有分枝杆菌复制子OriM的质粒pMV261及耻垢分枝杆菌mc2155由Torin博士［3］惠赠；多启动子真核共表达载体pBudCE4.1购自Invitrogen公司；质粒pUC118购自大连宝生物公司；质粒pEGFPC1，E.coli Top10为本室保存；小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自第三军医大学药教研室. 质粒DNA小量抽提试剂盒、PCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；小量组织/细胞总RNA抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（NMA）、限制性核酸内切酶、高保真ProbestTaq酶、T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarker DL2000等均购自大连宝生物公司；Lipofectamin 2000购自Invitrogen公司；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德公司；RPMI 1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.

    1.2方法

    1.2.1pZM03质粒的构建根据GenBank（登录号：NM_006433）中人GLS的cDNA序列，设计引物P1，P2，分别含有BspEI，HindIII和BamHI酶切位点. P1的序列为 5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGGGCCGTGACTACAGGACCT3′; P2的序列为5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCACCTGAGGTCCTCACAGAT3′，引物由大连宝生物公司合成. 由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在引物设计中去除了GLS的分泌肽序列. 根据小鼠IL12 p40，p35两亚单位编码基因的序列设计P3，P4引物，分别含有EcoRI，NotI和HindIII，KpnI酶切位点. P3的序列为5′GAATTCGCGGCCGCATATGGGTCCTCAGAAGCTAAC3′; P4的序列为5′GATAAGCTTGGTACCGGATCCTCAGGCGGAGCTCAGAT3′. 引物由上海博亚生物公司合成. 根据pAL5000中OriM的编码序列设计P5，P6引物，分别含有BamHI，NheI和NheI，HindIII酶切位点. P5的序列为5′GGATCCGCTAGCTAAAGCCAGGTGAGCCCACCAGCTC3′; P6的序列为5′GCGAAGCTTGCTAGCGCACTACAACGGAGTTCGCCACGT3′.引物由上海博亚生物公司合成. pZM03质粒的构建路线见图1.

     图1pZM03真核共表达质粒的构建程序

    1.2.2重组质粒的细胞转染及表达小鼠巨噬细胞株RAW264.7以含100 mL/L小牛血清RPMI 1640培养液，置24孔板内，以37℃, 50 mL/L CO2培养，按转染试剂盒说明书用重组pZM03质粒和空质粒pBudCE4.1分别转染RAW264.7细胞. 转染48 h后分别收集实验孔及对照孔的细胞做:①以RTPCR法对两种目的基因的mRNA进行检测：抽提细胞总RNA进行逆转录，以各自的cDNA为模板，分别以P1和P2， P3和P4为引物，作PCR扩增；②GLS表达产物的检测：取出培养孔内细胞爬片进行免疫细胞化学检测，具体方法按照试剂盒说明进行.

    1.2.3重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建及其靶向性检测将对数生长期的mc2155菌株以预冷的100 mL/L甘油在4℃低温洗涤3次［4］，取90 μL感受态细菌加入10 μL纯化的pZM03质粒，轻轻混匀，冰浴10 min，转入预冷的1 mm电转杯中，2500 V，4 ms电击一次，迅速加入0.8 mL完全7H9培养基，37℃孵育3 h后涂布到含Zeocin 40 mg/L的7H10固体平板上，37℃孵育72 h后挑取阳性菌落增菌后抽提质粒，同时取1 mL菌液，离心弃上清，沉淀加入0.5 mL三蒸水，100℃热裂解8 min，取上清2 μL或质粒抽提物1 μL为模板，分别作GLS，IL12和OriM的PCR扩增. 以鉴定正确的重组菌1×1011 cfu/L感染培养的RAW264.7细胞，12 h后取出培养孔内的细胞爬片进行抗酸染色并观察. 同时将鉴定正确的重组菌划线传代5～10代后再次以PCR法进行鉴定，以观察重组质粒的稳定性.

    2结果

    2.1pZM03质粒在小鼠RAW264.7细胞中的转录与表达在转染有pZM03质粒的RAW264.7细胞中同时扩增出了编码人GLS和小鼠单链IL12的cDNA片段（图2）. 图中第1，4泳道分别为约267 bp的GLS片段和约1671 bp的IL12片段，与理论预计值图2pZM03真核共表达质粒转染RAW264.7细胞后转录产物的RTPCR结果完全相符. 用山羊抗人GLS抗体为一抗，生物素化的兔抗山羊抗体为二抗,对pZM03质粒转染的小鼠RAW264.7细胞作免疫酶染色，发现在细胞质中有强阳性染色颗粒（图3）.A:用pZM03质粒转染后的RAW264.7细胞;     B: 用pBudCE4.1质粒转染后的阴性对照.
图3pZM03质粒转染RAW264.7细胞48 h后颗粒溶素的表达×250

    2.2重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建及其靶向性检测以重组菌裂解物或质粒抽提物为模板，作GLS，IL12和OriM的PCR扩增（图4）. 图中第1，2和3泳道分别为约267 bp的GLS片段、约1671 bp的IL12片段和约1914 bp的分枝杆菌复制子OriM片段，与理图4携带pZM03质粒的重组耻垢分枝杆菌菌落PCR鉴定论预计值完全相符. 感染RAW264.7细胞后进行抗酸染色观察证明，重组菌具有良好的靶向递送能力，能够在目标细胞中巨量富集，镜下可见红色的抗酸染色菌株在巨噬细胞胞质中富集，巨噬细胞核呈蓝色，在细胞间隙中只有极少量散在分枝杆菌的存在（图5）.
图5感染12 h后RAW264.7细胞中重组分枝杆菌的富集×1000

    3讨论

    细胞免疫是宿主抗结核感染的主要保护机制，活动性结核病患者全身整体免疫状态倾向于Th2型［5-6］. IL12是一种功能强大的Th1型免疫反应诱导剂，外源给予IL12可产生Th2免疫状态向Th1型免疫状态的逆转. 在一个已建立Th2型免疫反应的感染动物中，外源给予IL12仍能诱导出一个独立的与新免疫原相关的Th1型免疫反应，Pollock等［7］发现能够促进Th2反应和强烈IgE反应的CPB2.8抗原当与IL12共同免疫小鼠时，依旧能够引发出Th1型反应并与一定程度上的保护作用有关. 将共表达小鼠单链IL12与分枝杆菌保护性抗原Ag85B的真核质粒免疫小鼠，通过细胞因子本身的生物学活性及其佐剂作用可以优化宿主抗结核的特异性免疫反应，诱导机体产生更加有效的免疫保护作用［8］. 同时IL12对维持一定数量的Th1记忆细胞也是必需的［9］，但IL12只能通过刺激免疫系统间接发挥作用，不能对巨噬细胞内的Mtb产生直接的杀伤作用.研究发现短尾猿用BCG第二次接种免疫后可激发2到9倍于初免时的Vγ2Vδ2+ T细胞扩增，这是由于激活了初免时的记忆性T细胞，产生的回忆性反应引起的，并且这种扩增可持续7 mo之久，其扩增强度与保护短尾猿免受致死性Mtb攻击有正相关［10］；另有学者利用来自PPD反应阳性健康者的外周血单个核细胞，研究了受抗原刺激后扩增的T细胞抑制巨噬细胞内分枝杆菌生长的作用，发现BCG活菌苗和Mtb全细菌裂解液刺激的记忆性T细胞能显著抑制分枝杆菌的胞内生长，而休眠T细胞缺乏此抑制能力，这表明休眠T细胞需要特定的抗原刺激来激活.耻垢分枝杆菌是人体的正常菌群，使用重组耻垢分枝杆菌菌苗，一方面可作为新型减毒有机体载体向巨噬细胞靶向递送GLS/IL12真核共表达质粒，另一方面还可对已经感染结核杆菌的机体进行二次免疫激发，以对结核病进行交叉基因治疗和免疫治疗（同时还可以结合药物治疗）的综合治疗. 其原理是利用耻垢分枝杆菌菌体抗原与IL12共同作用于结核感染的机体后，通过分枝杆菌属共同抗原促进并激发宿主针对结核杆菌的特异性细胞免疫，纠正机体的免疫状态，间接清除体内的结核杆菌；与此同时耻垢分枝杆菌还可以作为基因治疗的减毒生物体载体，将含有激活的细胞毒性T淋巴细胞分泌的GLS基因的真核共表达质粒pZM03靶向导入巨噬细胞中表达，通过GLS与传统药物完全不同的机制直接杀灭胞内潜伏的结核杆菌，从而阻断结核杆菌在巨噬细胞内的潜伏.我们将编码人GLS的DNA片段和小鼠单链IL12基因、分枝杆菌复制子OriM同时克隆入pBudCE4.1后，构建了可在分枝杆菌中复制，同时又可以在真核细胞中进行共表达的穿梭质粒pZM03，并转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，在体外从细胞水平同时检测到了两种基因的转录与表达产物，一方面表明在小鼠来源的巨噬细胞中同时获得此两种功能基因的表达是可能的，另一方面也证明利用分枝杆菌作为生物体载体靶向递送治疗性基因是可能的. 这为后续在活体动物模型中应用该方法研究GLS，IL12及耻垢分枝杆菌的协同细胞免疫作用机制和免疫治疗作用奠定了基础.

    【】

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